中性粒细胞细胞外陷阱网与牙周炎的相关性研究进展

2020-03-05王晓宇朱昭蓉吴亚菲赵蕾

国际口腔医学杂志 2020年3期

王晓宇朱昭蓉吴亚菲赵蕾

口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙周病科成都 610041

中性粒细胞（neutrophil）又被称为中性多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte），是人体内重要的免疫细胞，在先天性免疫反应中起到不可替代的作用，是抵御牙周致病菌入侵的重要因素。当受到刺激时，中性粒细胞通过趋化活动，定向移动至感染部位并发挥吞噬作用，从而杀灭病原体。Brinkmann等[1]于2004年首次报道观察到由中性粒细胞产生的中性粒细胞细胞外陷阱网（neutrophil extracellular trap，NET）。随后，越来越多的学者关注NET在机体免疫防御中的作用。近年来发现NET在牙周炎相关的免疫反应中发挥重要作用。本文就NET与牙周炎相关性的研究进展进行阐述。

1 NET与NETosis

NET是由中性粒细胞受刺激后产生的一种细胞外纤维网状结构，主要由染色质和细胞蛋白质组成。通过电子显微镜可以观察到，NET以直径15～17 nm的DNA-组蛋白复合物为骨架，上面嵌有最大直径约50 nm的球状结构，包括中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、组织蛋白酶（cathepsin，CTS）G等多种颗粒源性蛋白质，其中组蛋白通常包括H1、H2A、H2B、H3、H4等多种成分[1]。脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）可以通过水解NET的DNA成分，导致NET结构分解，说明DNA成分是NET结构中的关键组分。

中性粒细胞形成NET的过程被称为NETosis，被认为是一种有别于凋亡和坏死的新型细胞死亡程序。NET通过识别、诱捕并限制细菌等病原体扩散，同时高表达抗菌肽等抗菌成分以最终杀灭病原体。NETosis的类型主要包括自杀式NETosis（suicidal NETosis）和存活式NETosis（vital NETosis）[2]。

自杀式NETosis是一种伴随中性粒细胞死亡的NET形成方式，释放过程约120 min。中性粒细胞主要表现为细胞核去浓缩，细胞膜崩解，细胞核细胞基质混合，向细胞外排出自身DNA（self-DNA），表达纤维网状结构[3]。丙二醇甲醚乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）刺激中性粒细胞后，再通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的方式产生活性氧（reactive oxygen specie，ROS）从而诱导NET形成[1-2,4]。ROS包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢、羟基自由基以及一氧化氮等。应用NADPH氧化酶抑制剂二苯基氯化碘盐能显著降低甚至抑制NET的释放，也印证了这一激活途径[5]。该方式与Raf-有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）-细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路和蛋白激酶C密切相关[6]。此外，肽酰精氨酸脱亚氨酶（peptidylarginine dei-minase，PAD）4可以催化组蛋白瓜氨酸化，促进染色质区去致密化，从而促进NETosis[7]。因此，ROS和PAD4均在自杀式NET形成过程中发挥着重要的作用。

存活式NETosis是一种不伴随活化的中性粒细胞死亡且仍保持吞噬和趋化功能的NETosis，由细菌和细菌产物刺激产生，在30 min内迅速发生。其形成过程不依赖于Raf-MEK-ERK通路和ROS，革兰氏阴性菌大肠埃希菌通过Toll样受体（Tolllike receptor，TLR）4激活血小板，通过中性粒细胞与血小板直接相互作用产生NET；革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌则通过激活补体受体3和TLR2诱导NET形成，其形成表现为细胞内核膜保持完整，核DNA出芽并以囊泡形式释放，中性粒细胞的功能不受影响[8-9]。此外，Yousefi等[10]采用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor）刺激后，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和补体成分5a （complement component 5a，C5a）再次刺激下产生NET。该NET的DNA不是来源于中性粒细胞的细胞核，而来源于其线粒体，其形成依赖于ROS，并且不伴随中性粒细胞死亡。

目前，NET的检测方式和体外标志物尚无明确的金标准，可以通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜等观察NET结构，荧光显微镜共定位中性粒细胞来源的蛋白质，例如MPO和蛋白酶（proteinase，PR）3、NE等和细胞外DNA，以确定NET形成。免疫染色检测瓜氨酸化组蛋白的存在，通过PicoGreen®等荧光核酸染料检测无细胞DNA[11]、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay）测定MPO/NE-DNA复合体均可检测NET。高速多光谱成像流式细胞术[12]、基于SYTOX绿色核酸染料的流式细胞术同样可以定量NET[13]，而活细胞成像技术则可分析NET释放过程[14]。

2 NET与牙周炎

2.1 NET在牙周组织中的抗菌作用

NETosis可能是中性粒细胞对牙周炎发挥作用的主要防御机制之一。

White等[15]观察到在炎症牙龈组织中NET表达较健康对照组增高。Vitkov等[16]也在牙周炎患者的牙龈活体组织检查样本及牙周袋内化脓性渗出物中发现NET高表达，呈现纤维网状结构，在NET中有大量细菌与其机械缠绕，且在上皮表面紧密排列。当NET捕获细菌时，多数中性粒细胞的特征为常染色质和异染色质均质化、细胞核肿胀及DNA扩散。

Vitkov等[17]还通过扫描电子显微镜发现牙周炎患者龈沟液中存在NET，龈沟液中的NET分布平坦，仅有少量白细胞；但在化脓性龈沟渗出物中，可观察到三维缠结的NET和大量白细胞。而激光共聚焦显微镜显示龈沟液和化脓性龈沟渗出物中中性粒细胞均表现为细胞核肿胀、常染色质与异染色质无差异且citH3向细胞核内迁移。

1项病例对照研究[18]应用透射电子显微镜观察到，牙龈炎及牙周炎样本中的中性粒细胞存在典型的NETosis现象，表现为空核、核膜破裂、染色质排出到细胞外介质等。

共聚焦显微镜分析牙周炎样本发现，在牙龈中，NET相关成分细胞外瓜氨酸组蛋白H3（citrullinated histone H3，citH3）与大量CD177中性粒细胞阳性染色，而在健康样本中仅有少量citH3阳性，无CD177阳性中性粒细胞。citH3在牙龈炎样本的口腔上皮和龈沟上皮中的表达均较牙周炎样本高，表明NETosis在牙龈炎阶段达到最大活性，更可能发挥出其杀菌性。

NET较少与上皮直接接触，而是与黏附在牙龈上皮的细菌相结合，从而附着于上皮表面，保护牙龈免受游离细菌侵害，同时减少蛋白质水解酶对牙龈上皮的损伤[16]。NET在牙周组织中的定位表明，NET不仅在龈沟液中捕获大量细菌，阻碍细菌黏附和对牙龈上皮的侵入，还通过龈沟液的持续渗出消除龈沟中的游离细菌。

2.2 NET水平与牙周炎症程度的相关性

NET在牙周组织中发挥积极的抗菌作用，但过多的NET可能增加炎症负担，从而产生有害影响，而牙周治疗可以降低NET水平。1项病例对照研究[19]发现，在40名伴类风湿性关节炎的牙周炎患者中，NET与平均探诊深度和临床附着丧失呈正相关（P<0.05）；多因素Logistic回归分析显示，外周血NET水平与中重度牙周炎显著正相关，但不伴风湿性关节炎的牙周炎组的NET仅略高于正常对照组，且差异无统计学意义。牙周治疗可以显著降低伴类风湿性关节炎的牙周炎患者血清NET水平。该研究表明，NET水平与牙周炎的严重程度相关。但在另一项研究[20]中，NET水平与实验性牙龈炎探诊出血、菌斑指数、龈沟液量不存在相关性，提示牙周临床指标与NET的相关性可能与机体所处的炎症状态有关，但仍需要更多临床研究加以验证。

White等[21]发现，虽然牙周炎患者组与正常对照组外周血中性粒细胞产生NET水平相当，但是牙周炎患者降解NET的能力减弱，NET在牙周组织中存在时间加长。经牙周治疗后，牙周炎患者降解NET能力与正常对照组相当，中性粒细胞释放NET也明显减少。患者降解NET的能力降低可能与血浆DNaseⅠ浓度较低及血浆免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G和抗NET免疫球蛋白的游离轻链（free light chain，FLC）水平升高相关。DNaseⅠ的减少可能阻碍NET的DNA组分降解，而IgG和FLC可能与NET结构结合，从而提供物理屏障，进一步妨碍NET降解。

NET在牙周组织滞留虽然可能延长NET抗菌能力，但是NET衍生的瓜氨酸肽可能促进自身抗体的产生和宿主牙周组织的损伤。因此，NET的产生/降解失调可能是牙周慢性炎症导致组织持续破坏的原因之一。虽然目前尚不明确NET水平与牙周炎临床指标、牙周预后的相关性，以及NET在牙周炎症中发挥作用的机制等，但是牙周治疗可能通过恢复牙周炎患者降解NET的能力以降低NET水平，从而避免牙周组织的损伤。

3 NET与牙周致病菌

3.1 牙周致病菌对NET形成的诱导作用

多数牙周致病菌均可以诱导NETosis。White等[22]研究发现，与未受刺激的中性粒细胞相比，格氏链球菌、具核梭杆菌、小韦荣氏球菌和粘放线菌的刺激可导致中性粒细胞释放更多ROS。而格氏链球菌和小韦荣氏球菌同时刺激产生更多超氧化物。具核梭杆菌和格氏链球菌较其他细菌刺激生成更多NET。Jayaprakash等[23]证实，牙周重要致病菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）也可诱导大量ROS快速产生。Hirschfeld等[20]在龈上菌斑生物膜中检测到NET、中性粒细胞残留膜（CD177阳性），并在唾液及生物膜中发现NET相关蛋白质MPO、CTSG、抗菌肽LL-37、NE，证实了从菌斑生物膜中分离的口腔细菌可刺激NET形成。

Hirschfeld等[24]还对19种牙周致病菌进行了检测，发现NET的细菌捕获作用与Socransky复合体类型无关。红色复合体牙龈卟啉单胞菌，橙色复合体直肠弯曲菌、昭和弯曲菌、具核梭杆菌多形亚种，黄色复合体咽峡炎链球菌和格氏链球菌，紫色复合体小韦荣氏球菌及非复合体反刍月形单胞菌在捕获细菌的NET中显著增加；其他细菌特别是绿色复合体的差异则无统计学意义。与磷酸盐缓冲液对照组相比，痤疮丙酸杆菌、小韦荣氏球菌、格氏链球菌刺激的中性粒细胞产生更多的NET。痤疮丙酸杆菌、咽峡炎链球菌、直肠弯曲杆菌均刺激总ROS的产生，咽峡炎链球菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌和具核梭杆菌多形亚种刺激产生的细胞外超氧化物水平的差异有统计学意义。而NET杀菌测试显示，被检测的6种牙周细菌的活力均不受NET诱捕影响，说明NET不会阻碍牙周细菌生长或存活。

新近研究[25]发现，口腔链球菌和血链球菌诱导NET标志物citH3水平升高，而只有血链球菌上调MPO水平，口腔链球菌则诱导更多的ROS产生。伴放线放线杆菌白细胞高致毒性的JP2基因型也被证实可诱发NET产生[26]。

以上研究表明，部分牙周致病菌可以不同程度地刺激中性粒细胞产生ROS，并释放NET。其中NET主要通过捕获细菌发挥作用，而不是直接杀灭细菌。但牙周致病菌是否通过NADPH氧化酶的方式产生ROS并刺激NET形成仍有待进一步探索。

3.2 牙周致病菌对NET形成的抑制作用

大部分牙周致病菌刺激NET释放，而龈沟产线菌则被证实抑制NET形成[27]。龈沟产线菌或肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor）-α合并龈沟产线菌刺激的人中性粒细胞均不能形成NET，并且不诱导细胞外NE的释放。虽然龈沟产线菌未能减少格氏链球菌或咽巴斯德氏菌诱导形成的NET，但其可抑制PMA诱导的NET生成。通过深入探究龈沟产线菌抑制NET生成的机制，有助于进一步揭示牙周致病菌与NET生成和降解的关系。

不同牙周致病菌刺激ROS和NET产生的能力不同，部分细菌（如龈沟产线菌）甚至可以抑制NET的产生，表明牙周致病菌激活NETosis具有异质性。因此，需要更多的细菌相关研究以明确不同牙周致病菌与NET的关联。

3.3 牙周细菌与NETosis调控的关系

许多牙周细菌已被证明可以释放DNase水解NET结构，以实现NET逃逸。27种牙周致病菌包括红色和橙色复合体牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、具核梭杆菌、微小微单胞菌、中间普雷沃氏菌、星座链球菌、直肠弯曲菌和产黑素普雷沃氏菌等均表达DNase活性[28]。细菌分泌的DNase在体外刺激NET，发现NET被完全降解，证实了水解NET帮助细菌逃离的能力。

另有研究[24]应用NADPH氧化酶抑制剂、过氧化氢和次氯酸消除剂刺激细菌，以抑制ROS依赖的NADPH氧化酶途径，虽然金黄色葡萄球菌、格氏链球菌、直肠弯曲菌、具核梭杆菌多形亚种、反刍月形单胞菌总ROS的释放均减少，但细菌刺激的NET生成不受影响；且抑制TLR不影响牙周细菌刺激的ROS量及NET形成，提示部分细菌通过非NADPH氧化酶依赖性途径刺激NET形成。

以上研究表明，牙周致病菌可以表达DNase避免NET的捕获，而非NADPH氧化酶依赖性NET的形成，即存活式NETosis可能在宿主防御牙周细菌中发挥重要作用。

牙周致病菌毒性因子同样也可能参与调控NETosis，与此同时它们帮助细菌免疫逃逸NET。牙龈卟啉单胞菌相关毒性因子LPS浓度依赖性地启动NADPH氧化酶依赖性的自杀性NETosis[29]。同时，LPS活化中性粒细胞这一过程可能使体内NET过量，从而损害牙周组织。另一毒性因子牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶（P. gingivalispeptidylarginine deiminase，PPAD）可以帮助细菌逃逸NET[30]。用高毒力菌株牙龈卟啉单胞菌W83与PPAD缺乏的W83菌株刺激中性粒细胞，可观察到接受W83菌株刺激的中性粒细胞有更多完整的细胞核，表明W83菌株刺激更多的NET形成，而PAAD阻碍细菌诱导的NETosis。PPAD缺乏的W83菌株在NET内细菌存活数量低于野生型W83菌株，表明PPAD缺乏菌株被NET捕获并杀灭，证实PPAD能够帮助细菌免疫逃逸NET。

共聚焦荧光显微镜观察显示，接受牙龈卟啉单胞菌野生型菌株ATCC33277和W50刺激的中性粒细胞具有完整的细胞核和肌动蛋白细胞骨架结构，牙龈卟啉单胞菌毒性因子牙龈素同源突变株包括赖氨酸-牙龈素缺陷株K1A和精氨酸牙龈素缺陷株E8则诱导典型的NET结构形成，提示牙龈素可能抑制NET生成[23]。伴放线放线杆菌的特异性毒性因子白细胞毒素（leukotokin，Ltx）是一种NET诱导剂[31]。Ltx诱导中性粒细胞肿胀，在诱导3 h后可见NET结构，表明中性粒细胞发生NETosis是一个持续的缓慢的过程。10 ng·mL-1Ltx和伴放线放线杆菌低毒性菌株诱导NET的形成与PMA相似，而高浓度（100 ng·mL-1）Ltx和伴放线放线杆菌高毒性菌株则强烈诱导NET形成[32]，提示Ltx虽然具有强细胞毒性，但中性粒细胞仍能产生NET对其产生抗菌免疫反应。

当血清中存在补体时，接受伴放线放线杆菌刺激的中性粒细胞产生更多的NET，而通过热灭活去除血清中的补体可抵消NET生成；此外，阻断补体受体1（CD35）能显著降低放线杆菌诱导的NET释放[33]，说明血清补体及补体调理作用均参与NET的形成，提示部分细菌的补体灭活能力可能保护其他细菌免受NETosis侵害。

目前研究表明，牙周致病菌的毒性因子对NET的产生具有不同作用，部分毒性因子（例如LPS）可刺激NET产生，使中性粒细胞发挥抗菌作用；部分毒性因子（例如PPAD）则帮助细菌免疫逃逸NET。牙周致病菌不同毒性因子调控NETosis的具体机制还有待进一步深入研究。

对NET在牙周炎中的作用仍然存在争议。NET捕获和杀死微生物，对宿主发挥有益作用。同时，NET能排出自身DNA，可能引发自身免疫反应。因此，调节NET形成以确保其生产和清除过程平衡在牙周免疫防御中至关重要。

4 NET与掌跖角化-牙周破坏综合征

掌跖角化-牙周破坏综合征又被称为Papillon-Lefèvre综合征（Papillon-Lefèvre syndrome，PLS），是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，以弥漫性的手掌和脚掌过度角化、青春期严重而破坏迅速的牙周炎为特征，其患病率为1×10-6～4×10-6[34]。致病机制为编码CTSC的基因突变，导致无功能的中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（neutrophil serine protease，NSP），又被称为二肽肽酶（dipeptidyl peptidase，DPP）Ⅰ的产生。NSP包括NE、CTSG、PR3以及NSP4。

PLS患者继发于CTSC缺乏的中性粒细胞缺陷，导致NSP不能被激活，其累计效应可能共同破坏牙周组织。与健康对照组相比，PLS患者NET及NET相关结合蛋白酶（NE、MPO、CTSG）显著降低或者缺失；患者血浆中不存在LL-37[35]。Sørensen等[36]的研究发现，PLS患者缺乏NE、CTSG、PR3，并且不能形成NET。PLS患者中性粒细胞中离子毒素刺激的由人源性阳离子抗菌肽（human cathelicidin antimicrobial peptide，hCAP）-18形成的LL-37显著减少，其可能机制是由于缺乏PR3介导的蛋白质水解，PLS患者不能将心源性阳离子抗菌肽加工成抗菌肽LL-37。NE是NET形成所必需的[37]，提示PLS患者可能因为缺乏NE所以不能有效形成NET。PLS患者中NET相关组分NE、CTSG、LL-37等的缺乏可能影响中性粒细胞的抗菌功能，导致PLS患者组织中致病微生物持续存在。

中性粒细胞活化后释放的炎症介质在细胞密度为2×107～4×107cm-3时达到最高值，超过该密度后，聚集性NET会水解多余介质。当高密度的PLS患者中性粒细胞与NET诱导剂共培养时，不会降解白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和单核细胞趋化蛋白-1，反而产生更高浓度的炎症介质[38]，提示PLS患者不能有效形成聚集型NET以降解细胞因子和趋化因子，最终导致局部免疫炎症状态旺盛，造成持续性的牙周组织破坏。

综上所述，多数PLS患者无全身性感染，可能与中性粒细胞特异性定位和机体遭受细菌攻击部位有关。PLS患者缺乏NET抗菌活性，可能导致中性粒细胞对刺激物过度反应，产生过多促炎细胞因子；同时，中性粒细胞无法形成聚集型NET，从而降解炎症介质的蛋白质水解能力失效，缺乏对细胞因子和趋化因子的反馈机制，这可能是PLS患者持续的牙周炎症破坏的重要原因之一。