生长分化因子9对卵巢功能的影响和调控

张印峰，王会妍，张云山

卵泡是卵巢的主要组成部分，其形成、发育和功能是影响卵巢功能的关键因素之一。哺乳动物卵母细胞在卵泡中的发育过程涉及一系列细胞间信号转导事件，其中卵母细胞与颗粒细胞之间的双向通讯是一个重要的组成部分，包括营养物质及信号的交换，在卵泡形成的整个阶段，通过神经-内分泌以及旁分泌/自分泌因子组成的复杂调节网络协同作用，卵母细胞和颗粒细胞之间实现同步化通讯，协调生长分化。

转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）超家族是哺乳动物中最大的蛋白分泌者家族，其成员包括TGF-β、抗苗勒管激素（AMH）、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白（BMPs）和生长分化因子（growth differentiation factor，GDFs）等，这些蛋白以前肽前体形态合成，而后作为同源二聚体或异源二聚体被进一步加工和分泌。近年来，作为卵母细胞源性的蛋白家族成员，GDF-9和BMP-15（又称GDF-9B）的生物和生理特性受到了广泛的研究，在多种哺乳动物中均发现这两种因子可在卵泡发育阶段调节颗粒细胞及卵泡膜细胞的生长、分化和功能，并在卵母细胞的发育成熟中发挥关键作用，从而影响卵巢功能，是哺乳动物生殖系统中重要的影响因子。

1 GDF-9的发现及一般概述

早在1993年，GDF-9作为TGF-β超家族的新成员被发现，McPherron等[1]以已知TGF-β家族成员保守序列为模板，设计寡核苷酸引物克隆cDNA而获得的，人GDF-9基因定位于5q31.1染色体上，包含2个外显子，长度分别为397 bp和968 bp及1个1.6 kb内含子。有研究发现GDF-9蛋白的mRNA在雌鼠卵母细胞卵泡形成过程中均有表达，在始基卵泡中低表达或无表达，在发育卵泡的所有阶段中强表达，在排卵的卵母细胞中亦有表达[2]。Ahmad等[3-4]的研究发现，在多种哺乳动物的进化演变过程中，与TGF-β家族其他成员相比，GDF-9基因表现出极大的变异和迅速的演变。该研究对32种哺乳动物进行系统发生分析，结果显示人科分支中GDF-9基因核苷酸序列的多个密码子位点受到了阳性选择，其中如丙氨酸、精氨酸、赖氨酸等对信号传导具有重要作用，这也提示了GDF-9蛋白的重要性和特殊功能，及其在哺乳动物生殖中的重要意义。

2 GDF-9的信号通路

GDF-9特异性结合于跨膜丝氨酸-苏氨酸激酶受体ALK5[5]及BMPRⅡ[6]，当与GDF-9结合时，这两型受体形成异源二聚体复合物，Ⅱ型受体（BMPRⅡ）激活Ⅰ型受体（ALK5和ALK6）。Ⅰ型受体一旦被激活，可使受特异性受体调控的SMAD蛋白（RSMAD）磷酸化，通过与普通SMAD（Co-SMAD或SMAD4）相互作用传导信号入核，随后这种SMAD复合体转运至细胞核内与特异性转录因子相互作用以调节靶基因的表达，引发相应的转录和翻译过程，诱导细胞增殖。这个过程受Ⅰ型受体以及Smad2、Smad3蛋白的共同调控。

3 GDF-9在卵泡发育中的作用

早期针对卵母细胞与颗粒细胞之间双向沟通的研究多集中在颗粒细胞及卵丘细胞对卵母细胞的调节和营养作用，而最近有更多的研究证实，卵母细胞通过产生可溶性因子影响颗粒细胞的增殖、分化及功能并发挥关键作用。20世纪70年代研究显示，去除卵泡内的卵母细胞会破坏卵泡的生长发育进程，使格拉夫卵泡自发转化为相应黄体[7]，而近20年研究发现卵母细胞可通过分泌卵母细胞源性因子调节卵泡的生长分化及决定自身命运，包括GDF-9、BMP-15等在内的卵母细胞分泌因子（oocyte secreted factors,OSFs）在卵泡发育过程中的各个方面发挥重要作用，例如调节促进卵泡生长，控制卵巢功能相关因子的产生，有助于调控基因表达、细胞代谢和凋亡。

3.1 GDF-9参与调节卵泡发育、卵丘扩张 GDF-9参与了初级卵泡向次级卵泡转化阶段的发育过程。Diaz等[8]在小鼠实验中发现，GDF-9参与调节小鼠颗粒细胞的分化，特别是窦前颗粒细胞向卵丘细胞的转化。卵丘扩张的过程表现为卵丘卵母细胞复合体（COCs）中产生富含透明质酸的细胞外基质，透明质酸是COCs细胞外基质的主要成分，是透明质酸合酶2（HAS2）的下游产物，其表达受黄体生成激素（LH）水平升高影响而下调。目前研究发现包括GDF-9在内的卵母细胞源性因子通过内分泌、旁分泌机制来调控卵丘扩张的过程[9]。

3.2 GDF-9参与调节相关功能蛋白、因子的产生GDF-9可与BMP-15协同作用调节颗粒细胞中某些蛋白的表达，包括抑制素、LH受体、酪氨酸激酶受体（Kit）配体（KITL）等。KITL在卵母细胞的生长发育中至关重要，其表达水平受旁分泌因子和内分泌激素水平控制，已证实GDF-9抑制颗粒细胞中KITL的表达[10]。GDF-9除了可以促进颗粒细胞的有丝分裂外，在调节激素[如卵泡刺激素（FSH）、胰岛素-Ⅰ和雄激素等]水平方面亦发挥作用[10]。另外还发现GDF-9可促进影响排卵的重要因子前列腺素E2（PGE2）的生成[11]。

3.3 GDF-9参与调控生殖系统相关基因表达 学者们认为GDF-9与卵丘扩张相关基因HAS2和PTX3的上调有关[12]，可促进HAS2表达、透明质酸合成，从而参与调节卵丘细胞表型、促进卵丘扩张。Li等[13]发现在鸡的卵泡中，GDF-9可通过促进FSH受体及StAR基因的表达发挥其调节孕酮的作用，表明GDF-9还参与了与排卵和黄素化有关的靶基因的调控。目前已基本确定卵巢衍生的TGF-β超家族成员在抑制颗粒细胞产生孕激素及随后的黄素化中发挥不可或缺的作用，是卵巢功能重要的调节因子。

3.4 GDF-9参与调控卵巢细胞代谢、凋亡 GDF-9与调节颗粒细胞的糖酵解和胆固醇合成有关，这是丙酮酸、乳酸和胆固醇生物合成途径中的产物经间隙连接滋养卵母细胞的必要过程[14]。另外，研究发现GDF-9等卵母细胞源性因子对促进颗粒细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达及抑制颗粒细胞和卵丘细胞中的促凋亡蛋白Bax的表达也有保护作用[15]。学者们将卵母细胞从COCs中移除后发现颗粒细胞的凋亡水平增加，而将卵母细胞加回颗粒细胞培养环境后，这种情况被逆转，表明GDF-9在防止颗粒细胞凋亡中起重要作用。Li等[13]的研究还发现GDF-9可促进颗粒细胞的细胞周期进程，调节相关基因转录，加强DNA复制并抑制凋亡。

4 GDF-9在卵母细胞成熟过程的作用

卵母细胞的核质成熟过程驱动其本身减数分裂、受精并支持胚胎形成的早期胚胎发育能力，而存在于卵母细胞与颗粒细胞之间的双向通讯对卵母细胞的核质成熟过程是必需的[16]。研究证明，卵母细胞产生的GDF-9等因子可诱导卵丘细胞中正向调节因子的产生，反过来作用于其本身。

有研究分别在牛[17]、小鼠[18]、山羊[19]和猪[20]中证实，在体外培养成熟（IVM）过程使用重组GDF-9或去颗粒细胞裸卵处理COCs可使个体的囊胚形成率和产仔量增加，这意味着与体内成熟的COCs相比，体外成熟的卵母细胞也许不能分泌支持卵母细胞减数分裂、成熟的因子，此类受损的卵母细胞重新经卵巢源性因子处理后，可恢复良好的发育能力。进一步研究发现，GDF-9及其与BMP-15协同在提高卵母细胞减数分裂能力中的作用也许与促进卵母细胞中更好的核质成熟、防止透明带硬化、正确的受精模式和谷胱甘肽过氧化物酶高表达有关[21]。Monte等[22]在体外培养绵羊的次级卵泡中发现，外源性补充GDF-9可促进卵母细胞的生长、增强线粒体功能及减数分裂恢复能力。Garcia等[23]将雌性狗的卵母细胞作为研究对象，也发现GDF-9对卵母细胞发育成熟有促进作用。

5 GDF-9与女性生殖内分泌功能的临床联系

通过上述两方面作用，GDF-9作为人类女性生殖功能调节因子之一，对颗粒细胞分化、卵泡形成及卵母细胞发育成熟等具有重要意义。GDF-9的异常表达可能与女性生殖内分泌失调，及随之引发的不孕存在一定的联系。

卵巢功能关键基因的变异与多囊卵巢综合征（PCOS）发生有关。有研究在PCOS患者中发现了GDF-9基 因 的 非 同 义 突 变（N5L，L40V，M45V，D57Y，R146C，Y342F，S425R，S428T），GDF-9的缺陷可能减少颗粒细胞凋亡率和减慢颗粒细胞生长率，从而增加异常发育卵泡的数量，但PCOS患者与正常女性的突变率比较并无显著差异[24]。Kim等[25]在小鼠中的研究发现慢性雄激素刺激可通过下调GDF-9而诱导窦卵泡生长停滞及PCOS相关表型。但关于GDF-9表达异常对PCOS致病的作用及具体机制仍有待进一步研究。

早发性卵巢功能不全（POI）是一种严重影响女性生殖健康的卵巢功能障碍性疾病，有着多种复杂的致病因素，其中遗传因素在POI的发生中至关重要，多项研究发现GDF-9基因变异在POI表型中发生率升高[26]。在体外实验中发现，GDF-9基因的K67E、P103S和S428T变异会引起GDF-9前蛋白错误折叠，导致成熟蛋白显著减少甚至几乎消失[27]。2017年一项中国POI患者全外显子组测序的最新研究显示，NOBOX基因一个新的纯合截断变异严重破坏了GDF-9基因的转录活性，可能通过降低GDF-9表达而导致POI发生[28]。还有研究报道POI患者中存在一些BMP-15基因的突变，此类突变会降低BMP-15与GDF-9之间的协同作用，引起POI[29]。除GDF-9本身的表达异常之外，其结合受体的异常表达也可间接地影响卵巢功能，研究显示，人颗粒细胞中ALK6的失调与卵巢储备功能下降和与年龄相关的生育力衰退有关[30]。

6 GDF-9与BMP-15的协同作用

GDF-9和BMP-15具有高度的氨基酸同源性和相似的蛋白结构。这两种因子都与卵巢的表达模式和功能密切相关，并相互协同作用。越来越多的证据表明GDF-9和BMP-15之间存在协同关系，形成GDF-9/BMP-15异源二聚体，作为有效调节颗粒细胞功能和提高卵母细胞质量的因子发挥作用[31]。

GDF-9和BMP-15分别与颗粒细胞中相应的受体结合，导致下游基因发生级联反应，通过miRNA-375发挥作用，影响Ⅰ型受体ALK4和Ⅱ型受体BMPRⅡ的表达水平以及SMAD信号通路的激活，进而影响卵丘细胞的增殖、扩张和凋亡[32]。Hobeika等[33]在人颗粒细胞中发现，GDF-9及BMP-15的联合应用可通过SMAD2/3及SMAD3信号通路有效地增强FSH刺激芳香化酶CYP19A1启动子活性的效应，提高CYP19A1的mRNA及蛋白水平，从而提高人颗粒细胞雌激素的生成。

7 结语

卵巢卵泡内卵母细胞及其周围颗粒细胞之间存在着复杂的细胞对话、通讯及相互作用的联系网络，卵母细胞源性因子组成的BMP/GDF系统调节控制着颗粒细胞的分化和功能、细胞间通讯、类固醇激素生成、COCs形成及扩张、卵母细胞质量和发育成熟能力、排卵以及黄素化。GDF-9作为其中的一个重要成员，发挥着不可或缺的作用。了解GDF-9作用的生物、生理学基础及相关影响因素，对于深入了解卵巢结构、功能，为一些生殖内分泌疾病所致不孕的女性患者制定最佳的临床辅助生殖技术治疗具有十分重要的意义，如使用药物调节GDF-9相关信号通路中的蛋白表达或在卵母细胞体外培养体系中加入GDF-9也许会为辅助生殖方面的治疗提供新的方法。