不同干细胞来源外泌体在牙周再生领域的研究进展

吴晓楠 马宁 侯建霞

1.青岛市口腔医院牙周科 青岛 266001；

2.青岛市市立医院东院区口腔科 青岛 266071；

3.北京大学口腔医院牙周科 北京 100081

牙周炎是一种慢性炎症性疾病，可导致牙周支持组织（包括牙龈、牙骨质、牙周膜和牙槽骨）发生进行性破坏，引起牙齿逐渐松动、脱落，进而影响发音、咀嚼和美观，是导致成年人失牙的最主要原因。此外，牙周炎还与全身多种疾病具有相关性，如糖尿病、心血管疾病、类风湿性关节炎等。

牙周治疗的最终目标是实现牙周组织的修复和再生，其关键在于使牙周膜纤维一端嵌入牙骨质，一端埋入牙槽骨，形成功能性软硬组织复合结构。目前，植骨术、引导性组织/骨组织再生术、局部使用生长因子等技术已在临床中用于牙周缺损的治疗并取得一定疗效，但上述方法仍存在一些不足，如易形成长结合上皮、再生硬组织的能力较差、引导性组织再生术的适应证较窄及膜降解时易塌陷等。因此，牙周组织再生不论在生物科学还是临床应用层面都面临巨大挑战。

近年来，干细胞、组织工程技术的发展及应用为牙周组织再生提供了新的途径。然而已有研究[1-2]发现，在采用干细胞移植治疗组织缺损的过程中：1）仅有＜1%的干细胞能够归巢并定植于组织缺损区，持续促进组织再生；2）干细胞的旁分泌机制发挥着比“分化、替代受损细胞”更为重要的作用。

在组织再生过程中，干细胞可通过旁分泌机制释放多种生物活性分子（如趋化因子、生长因子等），构建复杂的局部微环境，趋化周围的宿主干/祖细胞迁徙至损伤部位并增殖、分化，抑制受损细胞凋亡和炎性反应，促进血管新生，调节细胞免疫功能，诱导再生反应的发生[3-4]。外泌体作为干细胞旁分泌机制的重要产物，在组织损伤修复过程中发挥重要作用，本文对外泌体在牙周组织再生领域中的研究进展进行综述。

1 外泌体生物学特征

外泌体最初发现于体外培养的绵羊红细胞的上清液中，是直径40～150 nm的微囊泡，存在于多种细胞（如干细胞、肿瘤细胞、上皮细胞和神经细胞等）和体液（如唾液、乳汁、羊水、血清或血浆和尿液等）中，在蔗糖梯度中的沉降系数为1.10～1.21 g·mL-1。通过差速离心、密度梯度分离、市售试剂盒等方式富集外泌体，并根据粒径尺寸、利用特定的生物标志物对其进行分离、纯化[5-6]。

外泌体具有脂质双层膜结构，膜表面富含鞘磷脂、胆固醇和神经酰胺脂筏脂质[7]；内含丰富的蛋白质，包括膜转运因子、信号转导因子（如β-连环蛋白、Wnt）、细胞骨架蛋白（如β-肌动蛋白、肌球蛋白和微管蛋白）、在细胞黏附中发挥重要作用的跨膜蛋白（如CD9、CD63、CD81和CD82），以及参与蛋白质折叠过程的热休克蛋白[8-9]。其中，Alix、TSG101和CD63等蛋白质可作为外泌体的标记蛋白，用于外泌体的鉴定[10]。

此外，外泌体还携带有大量来源于其分泌细胞的生物分子，包括蛋白质、信使RNA（messenger RNA，mRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA，miR），作为细胞间通讯的载体，通过转运、内吞方式进入靶细胞，调节细胞基因表达，改变细胞命运[11]。外泌体中的生物分子与某些疾病具有一定关联性，可作为相关疾病的诊断方式。如与健康对照组相比，肺癌患者血浆外泌体中人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase）mRNA的表达水平显著升高[12]。Koppers-Lalic等[13]指出，外泌体RNA在细胞定型、分化和活性调节中亦发挥关键作用。

2 外泌体生成及分泌机制

外泌体最初由细胞膜表面发生内吞作用形成内吞体，位于内吞体细胞质侧的内吞体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）作为一种蛋白质复合物，可包裹特异分选的蛋白质、核酸等物质，构成含有囊泡的多泡体。而当ESCRT耗竭时，则可通过神经酰胺、跨膜蛋白等的作用辅助生成多泡体。随后，多泡体依赖于RAB家族对细胞内囊泡的运输控制，将囊泡定位于细胞膜，并在SNARE家族的调控下促使囊泡膜与细胞质膜融合后，将外泌体分泌至细胞外[14]。

调控上述协同过程的任意关键节点，即可干预外泌体的生成和分泌，如利用干扰素1诱导多泡体中ESCRT-1的组分蛋白质TSGl01类泛素化，从而促使多泡体转运至溶酶体降解，减少外泌体生成[15]。Song等[16]研究发现，肾脑表达蛋白（kidney and brain expressed protein，KIBRA）作为一种支架蛋白可参与囊泡运输、细胞迁移等过程，其与外泌体中的Rab27a相互作用，二者稳定存在且不被泛素化，从而使多泡体免于被降解。反之，耗尽KIBRA则可导致Rab27a降解增加，继而抑制外泌体分泌。

分泌至细胞外的外泌体可将其中的生物活性分子（mRNA、miRNA、蛋白质等）转运至靶细胞，调节细胞的生物学行为；同时也可进入生物体液内，以递送至远处靶细胞（类似于经典内分泌过程），从而参与炎症、免疫应答调控、血管生成、组织再生、凋亡等多种反应进程[6,17]。

3 外泌体诱导骨组织再生和血管新生的研究

牙槽骨是牙周组织的重要组成部分，实现牙槽骨再生是获得牙周再生的关键环节。外泌体作为携带多种生物活性分子的重要载体，可通过激活靶细胞成骨信号通路，诱导干细胞向成骨细胞分化，为牙槽骨的再生奠定基础。研究[18]显示，外源性间充质干细胞（mesenchymal stem cell）来源外泌体所递送的miR-151-5p可被内源性间充质干细胞吸收以促其成骨向分化；脂肪干细胞来源的外泌体可提高人原代成骨细胞的增殖和成骨活性[19]；成骨细胞来源外泌体内由于携带有成骨相关miRNA和蛋白质，可促进间充质干细胞向成骨方向分化[20]。Cui等[21]研究证实，前成骨细胞MC3T3-E1分泌的外泌体可通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路促进小鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化。

尽管目前关于外泌体直接诱导牙槽骨再生的研究甚少，但联合应用组织工程技术将外泌体移植于组织缺损处，实现骨引导、骨诱导和血管新生过程的发生，从而促使骨组织再生，已得到初步验证。

Narayanan等[22]研究发现，人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体可显著上调靶干细胞相关分子，如骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）9、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1的表达。其中，BMP9可通过有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径诱导间充质干细胞分化为成骨细胞，且其诱导能力优于BMP2；而TGF-β则可通过Smad-Jun氨基末端激酶（Jun NH2-terminal kinase，JNK）途径协同增强BMP9的骨化诱导功能[23-24]。此外，该研究组还将负载有外泌体的胶原膜植入无胸腺裸鼠背部4周后取材，观察到血管内皮生长因子表达上调，且有更多的新生血管和钙磷结晶体形成。其中，血管内皮生长因子作为一种有丝分裂原，可促进血管内皮细胞的增殖和迁移，增加毛细血管的通透性，从而诱导血管新生。

Zhang等[25]将人诱导多能干细胞来源的间充质干细胞分泌的外泌体与β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）相复合并移植于大鼠的颅骨缺损区，外泌体/β-TCP复合支架释放的外泌体可通过激活间充质干细胞的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）信号通路发挥骨诱导功能；并且与单纯β-TCP支架相比，外泌体/β-TCP复合支架具有更优异的成骨活性。Qi等[26]的研究也获得类似结果，且观察到外泌体处理组较未处理对照组有大量的血管生成。Li等[27]制备出负载有人脂肪干细胞来源外泌体的聚乳酸-聚羟基乙酸复合支架，体内体外实验证实该支架通过缓释外泌体，促进间充质干细胞迁移和归巢、增殖和成骨向分化（碱性磷酸酶、RUNX2、骨钙蛋白等相关分子表达上调），继而发挥较强的骨诱导能力，实现缺损骨组织的再生。

综上所述，在修复骨缺损过程中，相关细胞来源外泌体携带的生物活性分子与组织缺损区周围细胞（尤其是间充质干细胞）相互作用，可诱导其分化为成骨细胞并进一步增殖。而后成骨细胞可分泌碱性磷酸酶和钙盐结晶至细胞外基质中，促使基质成熟、矿化，并释放一系列成骨相关分子（如BMP9、TGFβ1、RUNX2、骨钙蛋白等）与细胞外基质中的钙、磷及胶原分子结合，同时伴随大量的血管生成以保证充足的血液供应，从而实现骨组织乃至牙槽骨的再生。

4 外泌体诱导牙周软硬组织再生的研究

牙周膜细胞（periodontal ligament cell）属异质性细胞群，除大部分成纤维细胞外，还存在一些能够表达间充质干细胞标志物（如Stro-1和CD146）的细胞，可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞等，具有多向分化潜能，是实现牙周软硬组织再生的重要基础[28]。朱斌等[29]提取人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体与人牙周膜干细胞共培养，体外实验验证其可促进牙周膜干细胞的体外增殖和成骨向分化。费栋栋等[30]研究证实，牙周膜干细胞分泌的外泌体可能通过携带着更多的KAT6A mRNA，介导靶细胞（牙周膜干细胞）KAT6A的表达上调、影响其组蛋白乙酰化水平，从而促进靶细胞的成骨分化。吴金燕等（第13次全国老年口腔医学学术年会论文汇编，武汉，2018.11）构建大鼠牙周缺损模型，通过体内实验证实乳牙牙髓干细胞来源外泌体可诱导牙槽骨再生及血管生成。

Mohammed等[31]将脂肪干细胞来源外泌体注入采用结扎法诱导的大鼠牙周袋内，4周后取材观察。组织学检查可见缺损区形成与健康牙周组织类似的结构（即有序的牙周膜纤维一端附着于牙骨质，另一端附着于牙槽骨）。研究者认为，脂肪干细胞和外泌体皆具一定的抗炎及免疫调节活性，并可通过促进不同种类细胞的迁移、分化和增殖以及血管新生，诱导组织的再生。

Chew等[32]将人胚胎干细胞源性间充质干细胞分泌的外泌体负载于胶原海绵，并将其置于大鼠牙周缺损处，观察到牙槽骨和功能性牙周膜纤维的再生。并通过进一步研究证实，外泌体通过CD73介导的腺苷受体活化AKT和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路，来促进牙周膜细胞的迁移和增殖。体外研究发现，外泌体与牙周膜细胞相遇后，几分钟后即被细胞迅速吸收，15 min内诱发信号转导，并可持续促进与细胞迁移[胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）-1、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）-2]、存活和抗凋亡（IGF-1、Bcl-2和存活蛋白）、细胞增殖[IGF-1、FGF-2和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）]以及牙周膜基质形成（细胞外基质蛋白、胶原蛋白和骨膜蛋白）相关的基因表达。此外，IGF-1还可促进牙周膜细胞的成骨向分化，在骨组织的基质矿化中发挥重要作用。而骨膜蛋白作为一种细胞外基质蛋白，不仅支持成纤维细胞和成骨细胞的黏附和迁移，还可通过募集牙周膜成纤维细胞和成骨细胞以形成新骨和新牙周膜附着。

5 外泌体用于组织再生治疗的优势与风险

在再生医学领域中，应用外泌体作为多种生物活性分子载体的“无细胞再生策略”具有诸多优势，主要包括：1）几乎不具有细胞毒性和低免疫原性，体内同种异体给药后免疫排斥的可能性较低，具有广阔的应用范围[33]；2）可规避直接进行细胞移植所存在的栓塞、感染扩散等潜在风险，具有一定的生物安全性[34]；3）可制备成方便储存和临床应用的生物制剂，-20 ℃保存6个月不丧失生物活性[35]。

然而，目前外泌体携带各种生物活性分子在细胞间进行通讯交流的机制尚不明确，无法进行精确调控，且存在一定风险。研究[36-37]发现，间充质干细胞来源的外泌体可通过向邻近细胞传递相关miRNA或激活信号通路等方式促进肿瘤的发生和发展。癌细胞可利用外泌体向局部微环境中的正常细胞释放信号，促使其癌变[38]；发生远处转移的癌细胞所释放的外泌体具有更强的诱导细胞迁移的能力[39]。

此外，外泌体在体内的生物学分布情况是其是否具有毒性的重要决定因素之一。采用外泌体进行再生治疗时，需明确其在体内的输送路径、剂量、生物学分布及代谢动力学特点，方能实现引导外泌体抵达组织缺损区发挥功能、保证其临床应用的安全性。

6 展望

近年来，研究发现干细胞是通过旁分泌机制释放外泌体等载体介导细胞间通讯交流、激活靶细胞信号通路，以影响微环境中细胞的生物学行为，从而诱导缺损组织的再生。如上所述，单独或结合组织工程技术，采用干细胞来源的外泌体修复缺损的牙周组织尽管已取得初步成果并具备一定优势，但仍有许多问题亟待解决。外泌体的提取和纯化技术、应用过程中的有效性和安全性、诱导牙骨质再生、获得功能性牙骨质/牙周膜/牙槽骨软硬组织复合结构、比较不同种类细胞来源的外泌体诱导再生的优劣特性、明确外泌体诱导再生的作用机制等是今后研究的重点。因此，利用外泌体结合组织工程技术为牙周组织再生提供新的思路，具有重要的研究意义和广阔的应用前景。