NLRP3参与的细胞焦亡在眼科疾病的研究进展

宋兆威，李志坚，王晓慧，李华章

0引言

炎性体是位于细胞质内的多蛋白复合物，它负责促进炎性细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)的成熟，以及激活高度炎症形式的细胞死亡和焦亡。在感染或细胞应激后，炎性体被组装、激活并参与疾病的宿主防御和疾病的病理生理过程[1]。

经典炎性体是响应病原相关分子模式(PAMP)或损伤相关分子模式(DAMP)而在细胞质中激活caspase-1的媒介。 典型炎症小体由辅助蛋白和自身寡聚化支架蛋白组成，通常属于核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族。 NLR蛋白含有三个共同结构域：C末端富含亮氨酸的重复序列(LRR)，中心核苷酸结合寡聚化(NOD / NACHT)结构域和N末端半胱天冬酶募集(CARD)或pyrin(PYD)结构域。 黑色素瘤-2(AIM2)蛋白中不存在的非NLR含有PYD信号传导结构域和结合HIN-200结构域的DNA。 LRR负责配体识别和自身抑制，NACHT结构域使用ATP激活信号复合物，CARD / PYD结构域介导同型蛋白质-蛋白质相互作用。 迄今已鉴定出四种经典炎性体——NLRP1，NLRP3，NLRC4和AIM2[2]。含 Pryrin 结构域蛋白 3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性体是目前研究较多的炎性小体，大量活性氧(ROS)产生后能够激活NLRP3，而NLRP3激活后可以活化caspase-1，引起细胞焦亡。细胞焦亡是近年来的研究热点，NLRP3在焦亡通路中扮演着重要角色，目前在眼部疾病中对其的相关研究较少，对NLRP3的进一步研究对眼科疾病的诊疗有着重要意义。

1含Pryrin结构域蛋白炎性体

核苷酸结合寡聚化结构域(NOD) 样受体家族NLRP3炎性体是针对广泛的微生物病原体和医学相关物质(例如结晶)而组装的。组装后，炎性体可作为pro-caspase-1的活化平台。然后，活化的caspase-1将IL-1β/ 18的前体加工成成熟形式[3]。NLRP3炎性体的形成和活化可能是许多退行性疾病的关键致病机制，如动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、肾小球硬化、肺纤维化和肝硬化[4-7]等。

NLRP3炎性体的激活需要两个信号：信号1是来自TLR或细胞因子受体的引发信号;信号2是来自危险信号或微生物产物的激活信号，通常导致细胞钾外流和线粒体ROS产生[8]。引起NLRP3炎性体激活的形式包括：ATP和K+外排、溶酶体不稳定和无效的吞噬作用、ROS、ER应激和未折叠蛋白反应(UPR)、Ca2+信号传导、去泛素化、微小RNA(miRNA)，其中最重要的是ROS[1]。

2细胞焦亡

焦亡(pyroptosis)是细胞死亡的促炎形式，并且依赖于IL-1β、IL-18和警报HMGB-1。Caspase-1是炎症性半胱天冬酶的前体，以pro-caspase-1(一种无活性的酶原)的形式存在于细胞胞质中。pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的促炎细胞因子IL-1β和IL-18需要caspase-1的激活。活化的caspase-1可引起细胞焦亡，其特征是细胞裂解和细胞质内容物释放到细胞外空间。

形态学上，细胞焦亡似乎是细胞凋亡和细胞坏死的组合，涉及质膜完整性的破坏和细胞质内容物向细胞外空间释放。焦亡细胞的质膜出现破裂，随后迅速重新密封和肿胀，并在细胞核周围形成一个球状的囊泡。在细胞焦亡期间，垂死细胞的大小会出现显著的增加。随着焦亡细胞的膨胀，细胞核变圆、皱缩。与凋亡细胞相反，焦亡细胞保持了核的完整性； 与凋亡细胞相同，焦亡细胞的DNA片段化，在TUNEL染色下表达阳性[2]。

3 NLRP3炎症小体与细胞焦亡的关系

除了IL-1β和IL-18的成熟之外，焦亡还与炎性体的激活有关[9]。焦亡的特点包括caspase-1依赖，DNA片段化，细胞膜完整性的快速丧失和炎性细胞因子释放[10]。炎性体的生化功能是激活caspase-1使IL-1β和IL-18成熟以及诱导细胞焦亡。细胞被外界刺激诱导caspase-1活化的过程离不开炎症小体的调节与控制，所以炎症小体的激活与活化是细胞焦亡的关键步骤。

4眼部相关疾病的研究

4.1 NLRP3与年龄相关性黄斑变性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是一种神经退行性疾病，可侵袭黄斑，造成不可逆转的失明。对于干性ARMD，目前没有有效的方法可以缓解和治疗，视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)死亡和继发性光感受器变性这两种特征性变化导致干性ARMD晚期的中心视力丧失。因此，了解对视网膜造成破坏性影响的基本机制及因素至关重要[11]。

ARMD中RPE细胞死亡的机制尚未完全阐明。几项临床和实验证据表明，氧化和脂褐素介导的光氧化损伤具有重要的病理生理作用[12]。NLRP3炎性体也有助于继发于ARMD的RPE细胞死亡[13-14]。实际上，已经在受ARMD影响的RPE细胞中证实了NLRP3炎性体的激活[13,15],并且有报道发现ARMD患者的玻璃体内和全身的IL-1β和IL-18的水平增加[16-17]。Carolina 等[10]发现未接触炎性小体的细胞表现出延迟的细胞裂解、质膜起泡和细胞收缩，TUNEL阳性DNA片段化，膜联蛋白V阳性/ PI阴性细胞染色，以及缺乏IL-1β和IL-18释放。 相反，接触炎性小体的细胞表现出细胞肿胀和早期细胞裂解，TUNEL阳性DNA降解，PI阳性细胞染色，caspase-1活化和IL-1β和IL-18的释放[18]。研究结果表明，接触炎性小体可以将RPE细胞中光氧化损伤诱导细胞的死亡机制从细胞凋亡转变为细胞焦亡。Wang等[19]观察到ARMD患者中NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的mRNA水平增加。在体外，成体视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)细胞系中的氧化应激或脂多糖(LPS)刺激引起类似的增加，并且siRNA转染的敲除NLRP3的细胞中这种增加受到抑制。 表明外源性炎症刺激和氧化应激都可以通过caspase-1激活触发人RPE细胞中的NLRP3炎性体激活。以上数据表明，NLRP3及细胞焦亡在ARMD的发生机制中起到了关键的作用，让我们对未来ARMD的治疗有了新的想法和思路，NLRP3可以作为以后ARMD研究与治疗的新的靶点。

4.2 NLRP3与年龄相关性白内障年龄相关性白内障多见于50岁以上的中老年人，是目前全球主要的致盲原因，但其发病机制至今尚未阐明，了解白内障的发病机制及其通路中的相关因子，可以为今后预防及治疗白内障提供新的有效方式。

Alexander[20]的研究显示VEGF-A的增加足以引起眼部的多种老化疾病，包括白内障以及ARMD。在晶状体中，VEGF-A的增加诱导了与ERK过度活化相关的年龄相关性混浊，氧化损伤和IL-1β的更高表达。靶向NLRP3炎性体组分或Il1r1不仅强烈抑制VEGF-A诱导的白内障形成，而且强烈抑制ARMD的形成。这些发现表明VEGF-A诱导的和NLRP3炎性体介导的IL-1β激活对多种不同的眼部老化疾病具有共同的致病作用，靶向NLRP3或Il1r1可以抑制VEGF-A诱导的年龄相关的白内障发生。据报道NLRP3炎性体的特定化学抑制剂可用于治疗这些老化疾病[21]。IL-1β阻断剂在预防或抑制ARMD或与年龄相关性白内障形成方面也具有临床益处[22]。在年龄相关性白内障的形成机制中，NLRP3占有重要的中心地位，NLRP3抑制剂可以有效抑制这个过程的发生，所以NLRP3抑制剂可以作为年龄相关性白内障的一种新型治疗与缓解方式给我们新的启发与探索的方向。

4.3 NLRP3与翼状胬肉翼状胬肉是一种眼表疾病，特征在于鼻侧结膜上的翼状增殖组织，能阻碍视力，引起炎症并影响外观[23]。现在手术仍然是翼状胬肉的主要治疗方法，但会引起复发，移植物坏死和形成肉芽肿等并发症[24]。尽管已经用了很多方法来避免复发，但效果并不明显[25]。 因此，了解翼状胬肉的形成机制对于治疗和降低其发病率至关重要。

Sun等[23]通过原代培养人结膜上皮细胞(HConECs)和人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)，检测出与结膜细胞相关的因子水平。抑制caspase-1以限制caspase-1依赖性的细胞凋亡后，测量下游因子IL-18和IL-1β。发现翼状胬肉中的炎性因子表达显著增加，并且在H2O2处理的HPF和HConECs中存在caspase-1依赖性的上皮细胞焦亡，炎性因子的表达显著升高并且下游因子IL-18和IL-1β也升高。在caspase-1抑制后，IL-18和IL-1β的增加受到抑制。焦亡在翼状胬肉形成和进展的病理过程中发挥作用。

翼状胬肉的常见原因如紫外线辐射和其他类型的氧化应激，可以作为DAMPs引发细胞焦亡。在发生焦亡后，IL-18和IL-1β被激活并大量释放。激活的IL-18和IL-1β引起各种变化，例如纤维化、EMT、细胞凋亡和异常细胞增殖，所有这些都包括在翼状胬肉发生的机制中。因此，HPFs中这些焦亡因子的升高，是翼状胬肉的主要组成部分，可能在翼状胬肉的进展中起相当大的作用。NLRP3参与的细胞焦亡在翼状胬肉形成和进展中的重要作用使我们更好地了解翼状胬肉，并发现了翼状胬肉治疗的新的可能性，这将为今后翼状胬肉的治疗提供新的方法和思路。

4.4 NLRP3与糖尿病视网膜病变糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是一种多因素疾病，具有微血管、神经变性，遗传/表观遗传，免疫和炎症相关因子的复杂相互作用。 根据微血管变性和缺血性损伤的程度，DR可分为非增殖期(NPDR)和增殖期(PDR)[26]。

Sirpa等[27]研究结果支持NLRP3炎性体在PDR中是激活状态。 抗VEGF治疗降低了NPDR患者玻璃体中caspase-1的水平，提示炎症小体激活也参与NPDR，并且也支持炎性体和VEGF之间存在联系。 在患有牵拉性视网膜脱离(TRD)和新生血管形成等严重形式的PDR患者眼中观察到高水平的NLRP3。 与NPDR玻璃体样本相比，在PDR眼中检测到更高水平的IL-18。Mcc950是NLRP3炎性体的有效特异性抑制剂，Zhang 等[28]评估了Mcc950对高葡萄糖诱导的人视网膜内皮细胞(HRECs)的抗炎作用以及潜在的相关机制。在来自DR患者的手术切除的增殖膜中，观察到NLRP3、caspase-1和IL-1β的高表达。在高葡萄糖刺激的HRECs中，Mcc950抑制了NLRP3炎性体的激活和细胞凋亡。Chen 等[29]发现从DR患者获得的外周血单核细胞(PBMC)中NLRP3炎性体的表达升高; 在PBMC和玻璃体液中也观察到包括IL-1β和IL-18的促炎细胞因子水平升高。 这些数据表明NLRP3炎性体的激活可能促进DR的进展。这些发现使我们对DR的发病机制和发生发展有了进一步了解，其中NLRP3作为DR治疗的潜在因子，需要我们进一步阐明及探索NLRP3炎性体在DR形成过程中的分子机制。

4.5 NLRP3与干眼症干眼症(dry eye，DE)是最常见的眼表疾病之一，严重影响人的生活质量。 尽管尚未明确干眼症的发病机制，但越来越多的证据表明，眼表面的免疫炎症可能在干眼症的病理损害中起着重要作用[30-31]。但干眼症炎症发生发展的确切机制现在仍不清楚。

活性氧物质可激活NLRP3炎症小体并导致干眼小鼠模型中caspase-1自身激活和促炎细胞因子IL-1β的成熟[32]。Niu 等[33]的研究显示干燥综合征干眼症(SSDE)受试者中NLRP3 mRNA和蛋白质表达与对照组相比显著增加。非干燥综合征干眼症(NSSDE)的受试者也显示出高水平的NLRP3 mRNA表达。这些发现表明NLRP3炎性体可能与干眼症眼表炎症的发展有关。SSDE组的基线泪膜破裂时间(tear break-up time，TBUT)，荧光素染色(fluorescein，FL)和Schirmer测试值均显著低于NSSDE组中的数据。SSDE和NSSDE中NLRP3的表达水平可能与干眼症的严重程度有关。Zheng 等[32]用智能控制环境系统(intelligent controlled environmental system，ICES)诱导雌性4～6周龄C57BL/6小鼠的蒸发过强型DE。在ICES暴露1wk后发生ROS的升高，其在三种NLRP3炎性体组分(即NLRP3、ASC和caspase-1)的基因表达增加之前导致IL-1β释放的增加。 ICES暴露2wk后发生caspase-1活性增加。将含有0.3% N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)的滴眼液用于在ICES中饲养2wk的小鼠。NAC减少角膜荧光素染色并减少ROS产生，还下调NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β mRNA以及它们免疫染色的水平。它明显减弱炎性体介导的caspase-1的催化活性。干眼症小鼠模型显示，ROS生成的增加引发NLRP3炎性体的复合和活化，导致生物活性IL-1β分泌增加。NLRP3表达的增加也与环境诱导的DE疾病的严重性相关。以上这些研究结果为发现干眼病的患者的治疗提供了新的策略，开发抑制NLRP3复合物形成和活化的药物可能为治疗环境诱导的DE疾病提供新的治疗选择。

5小结

NLRP3炎症小体在许多眼部疾病中起着至关重要的作用，是危险信号诱导疾病发生发展的中心环节。而炎性体的激活与活化是细胞焦亡发生的关键步骤，NLRP3 炎性小体是炎症反应的核心，故而 NLRP3 炎性体与细胞焦亡的发生具有密切关系。目前，对其通路的确切机制以及分子间相互作用的研究较少。因此，进一步研究 NLRP3 介导的细胞焦亡通路在眼科疾病中的作用及机制，应用相关生物制剂或生物学方法阻断 NLRP3 的信号通路等研究，能够对眼科疾病的深入了解及治疗提供新的思路及新的治疗靶点。