微RNA在骨损伤诊断和治疗中的研究进展

杨文涛 关德宏

微RNA(miRNA)是短链非编码RNA分子，长度为19～25个核苷酸，广泛存在于生物体内[1]，是一种特殊的生物调节因子。成熟的miRNA可与目标信使RNA发生碱基互补配对，并诱导目标信使RNA降解或抑制其翻译，调控靶基因表达水平[2-3]。研究证实，miRNA对细胞的增殖、迁移和分化有重要调节作用，在骨发育和骨再生中也发挥重要调控作用[4]。

随着人口老龄化日益严重，交通运输业不断发展，骨科疾病发病率逐年攀升，大面积骨缺损、骨不连的发生率也有所上升。目前，自体骨移植依然是治疗骨缺损的首选方法[5]，但存在骨供应量有限，给患者带来额外痛苦等缺点，而miRNA的发现则为这些难治性骨折的治疗提供了新思路。本文对miRNA在骨损伤诊疗中的研究进展作一综述。

1 miRNA表达失调与骨损伤

miRNA与骨密度降低、骨质疏松、骨折等骨科疾病均存在密切联系，骨折发生和愈合过程中涉及各种调节因子，包括miRNA[6-7]。

1.1 miRNA在骨组织中的表达失调

Gautvik等[8]进行骨折风险研究，他们选取不同部位共102例活体骨样本，通过聚合酶链式反应分析和miRNA芯片技术检测相关miRNA含量,并进行对比分析，最后确定28个miRNA的表达水平与骨折相关。他们进一步分析发现，其中5个miRNA(miR-484、miR-328-3p、miR-27a-5p、miR-28-3p和miR-409-3p)与骨密度正相关，即这5个miRNA水平降低会增加骨折发生风险。不过，该研究中研究对象均为绝经后妇女，5个miRNA是否与雌激素相关，其变化是否适用于所有性别和年龄的人群，还需深入研究。

Chen等[9]对30例骨质疏松性骨折患者的骨折碎片进行研究，同时以30例行髋关节置换的骨关节炎患者的股骨颈区骨样本作为正常对照组，发现骨质疏松性骨折患者骨折碎片样本中miR-135b-5p表达水平明显高于对照组。进一步的体外细胞实验发现，miR-135-5p可通过调控骨特异性转录因子(Runx)2抑制成骨细胞的增殖和分化。该研究直接以骨质疏松性骨折患者的骨折碎片作为研究样本，极具代表性，但对照组与正常人骨骼样本的差异可能对研究结果存在影响，对此还需进一步探究。

以上两项研究中均采用人体骨组织作为样本，这限制了样本采集和miRNA的实时监测，但研究结果对骨科疾病的探索仍具有深刻意义。

1.2 miRNA在血液中的表达失调

相对于骨组织样本，血液样本易采集，且一定意义上可做到miRNA实时监测。Mandourah等[10]提取正常人、骨质疏松患者、骨质疏松性骨折患者共139例志愿者的血液样品，利用RNA测序技术对370个miRNA进行高通量筛选，发现40个miRNA出现差异性表达，最终确定miR122-5p和miR-4516表达水平下降与骨质疏松性骨折的发生存在密切联系。

Kocijan等[11]对153例骨折患者(绝经前女性46例、绝经后女性52例、男性55例)血液中187个miRNA进行聚合酶链式反应定量分析，发现骨折患者血清中miR-152-3p、miR-30e-5p、miR-140-5p、miR-324-3p、miR-19b-3p、miR-335-5p、miR-19a-3p和miR-550a-3p 的水平有明显改变，且与患者的年龄和性别无关。

Feichtinger等[12]进行骨折风险预测研究。他们提取36例轻度骨折患者的血浆，通过RNA测序、实时聚合酶链式反应定量分析等技术对可能产生影响的19个miRNA进行分析，发现多个miRNA对骨组织微结构有影响，其中miR-29b-3p、miR-324-3p和miR-550a-3p的表达水平降低，且与骨密度降低直接相关。该研究提示，一些miRNA的表达水平在骨折高风险人群(骨质疏松患者)、骨折患者与健康人中出现明显差异，这或可用于评估骨折风险。

以上研究包含了各年龄段和性别的患者，并实现一定程度上的实时监测，但人体血清成分复杂，其变化的影响因素也较多。

2 miRNA调节骨愈合

miRNA在细胞的特定时期表达，并能靶向调节组织细胞的分化、增殖、凋亡和迁移等过程[13]。骨组织的再生和血管化过程涉及干细胞的增殖、分化和迁移，miRNA参与这些过程中[14-15]。

2.1 miRNA对骨再生的调节作用

骨的形成和再生主要依赖于间充质干细胞(MSC)向成熟成骨细胞分化[16]，这一基本步骤的实现需激活包括转化生长因子(TGF)-β、骨形态发生蛋白 (BMP)和Wnt等在内的多种信号转导通路，这些信号转导通路均受miRNA调控[17]。以上信号转导通路的激活常导致下游核蛋白的表达，如Runx2、Osterix蛋白和环腺苷酸依赖性转录因子-4，它们可调控成骨细胞的发育。

Yang等[18]将经miR-21修饰的骨髓间充质干细胞(BMSC)/β-磷酸三钙复合材料用于填补动物骨缺损模型。术后6个月显微CT检查发现新骨形成较好，进一步研究发现，miR-21可通过磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K )/蛋白激酶B(Akt)/低氧诱导因子-1α途径促进骨再生，他们认为miR-21在体外可促进BMSC的迁移和成骨分化。Sun等[19]的动物实验证实，miRNA-21过表达可增加BMSC中骨桥蛋白和碱性磷酸酶(ALP)的表达，从而促进成骨，加速骨折愈合。

Sun等[20]研究发现，miR-26a可促进BMSC的骨钙沉积，提高ALP和骨钙素的水平，他们认为miR-26a有促成骨分化的作用。此外，他们将miR-26a用于骨不连的大鼠模型中，X线检查、苏木精-伊红染色和Masson染色实验均表明，miR-26a可明显增强成骨效果。实验还对miR-26a促进骨折愈合的分子机制进行研究，结果显示miR-26a通过Wnt/β-catenin信号转导通路，靶向抑制含骨硬化蛋白结构域蛋白1的表达，促进MSC的成骨分化，从而促进骨不连的愈合。

Zhang等[21]在体外成骨细胞培养实验中加入miR-218，采用蛋白质印迹法和细胞计数检测发现，miR-218可促进Runx2表达，从而促进成骨细胞成熟。Shi等[22]进行了进一步研究，他们将过表达miR-218的BMSC移植至股骨骨折小鼠模型中，通过X线和显微CT检查，机械测试，组织染色检测发现，miR-218可加速骨折愈合。

Ge等[23]研究发现，在骨折早期小鼠体内miR-374b的表达水平明显增高。随后的体外细胞实验发现，给予miR-374b，MSC中的ALP活性增加，成骨相关基因和蛋白的表达也明显增加，而利用抗miR-374b敲低miR-374b表达则出现相反结果。进一步研究发现，miR-374b可通过降解PTEN促进MSC的成骨分化，从而促进骨折愈合。

综上所述，miRNA在骨折愈合过程中发挥重要调控作用，通过调节部分miRNA的表达可促进成骨作用，最终达到改善骨折愈合的效果。miRNA在骨折延迟愈合、骨不连和骨缺损的治疗中具有潜在的应用价值。

2.2 miRNA对血管生成的调节作用

骨折通常伴有微血管破坏，形成局部低氧环境，这会刺激血管再生相关因子分泌，从而促进血管系统重建[24]。骨折后，新生血管可为局部组织提供营养，还可运输骨折修复所需的调控因子[25]，miRNA便是其中之一。血管生成常与成骨作用一起促进骨折愈合[14]。

一项体外细胞研究发现，含锂的生物陶瓷材料(Li-BGC)可直接促进人脐静脉内皮细胞的成血管能力[26]。随后的动物研究发现，Li-BGC也可促进新生血管向骨内生长。进一步研究证实，Li-BGC能促进BMSC生成含miR-130a的外泌体，外泌体中的miR-130a作用于人脐静脉内皮细胞，使Akt和核因子-κB(NF-κB)通路激活，PTEN蛋白表达下调，从而促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，最终促血管生成。该过程中，miRNA参与BMSC与血管内皮细胞之间的信号传导和反馈调节，同时具有促血管生成和促骨再生的作用。

Yan等[27]将MSC层整合到钛合金上，形成MSC片-植入物复合物(MSIC)，用于研究抗miR-138对复合体的影响。他们发现，抗miR-138具有促血管生成和骨钙沉积的作用。在小鼠皮下植入MSIC进行进一步研究发现，与加入miR-138和生理盐水相比，加入抗miR-138的MSIC可形成更为坚固的血管化骨组织，他们认为抗miR-138具有促血管生成和促进骨再生的作用。

Wang等[28]进行成骨细胞和H-型内皮细胞共培养实验，应用miRNA测序技术分析证实miR-143在血管生成以及成骨过程中具有重要作用。随后的临床实验发现，老年骨折患者血清中miR-143的表达水平低于年轻患者。动物实验发现，miR-143敲除小鼠中H-型血管生成和成骨细胞分化受到明显抑制，其给予基因敲除小鼠蛋白脱乙酰酶(HDAC)7可改善血管生成和骨再生，推测miR-143靶向作用于HDAC7以促进成血管细胞和成骨细胞的分化。

以上研究表明，miRNA在MSC和血管相关细胞中起着重要调控作用，可影响骨折过程中的血管生成和成骨作用。骨愈合过程中BMSC和血管相关细胞常相互联系[29]，其联系机制也值得深入研究。

3 miRNA对骨愈合的潜在诊疗价值

miRNA与骨折及骨愈合有着密切联系，血循环中的部分miRNA也会随着骨折的发生和发展出现变化。部分与骨质疏松性骨折相关的miRNA或可作为预测骨折风险的评估指标[30]。虽然骨愈合延迟及骨不连与患者的年龄以及骨折部位有关，但尚缺少客观的预测指标，骨折患者血液或骨折碎片中的miRNA水平或可作为参考，这有利于对高风险人群提前制定更为合理且有效的诊疗决策。

miRNA除可应用于疾病诊断中，在骨愈合延迟、骨不连和骨缺损的治疗方面也有巨大应用潜力[7]。动物实验发现，miRNA单独应用或与干细胞、生物材料联合应用，均能发挥良好的促骨愈合作用，但考虑到应用安全性，对miRNA相关的辅助治疗以及临床应用仍需开展进一步的研究和评估。

4 结语

随着生物技术的不断发展，学者们开始注意到miRNA的潜在诊疗价值。涉及miRNA治疗的专利逐年增加，开展相关研究的生物制药公司不断增多。目前，大多数miRNA相关药物仍处于Ⅰ期临床试验阶段。尽管miRNA在骨科领域应用的研究远落后于心血管疾病、癌症以及慢性伤口愈合等领域[31-32]，但随着研究的进一步开展，miRNA可能在骨相关疾病的诊断与治疗中得到更多应用。