抗苹果轮纹病菌植物筛选及反式茴香脑抑菌机理

谷晓杰，安丽，何晓婷，冯雪，杨春，武文卿，李少华，曹挥

(山西农业大学 农学院,山西 太谷 030801)

由贝氏葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的苹果轮纹病是目前制约苹果品质提升、产量提高的“头号祸根”,其在被害枝干上以菌丝体、分生孢子器及子囊壳进行越冬,条件适宜时产生的分生孢子成为该病的侵染源[1,2]。苹果轮纹病主要危害苹果树的枝干及果实。病菌侵染枝干后发病部位凸起,周围树皮裂开并翘起。次年以此发病部位为中心向四周不断扩展,形成同心轮纹状病斑。该病害具有潜伏期,田间青果被侵染后有近50%不表现症状,在果实成熟或储藏过程中才开始发病,侵染后期出现黑色僵果,并在表面产生子实体[3～7]。

利用植物自身防御功能及植物与有害生物协同进化产物—次生代谢物质进行植物源农药研发是当前农药研究的一个热点[8～10]。八角茴香(Illiciumverum)属于木兰科八角属,主要分布在我国云南、贵州、四川等省,是我国重要的“药食同源”树种之一[11]。八角茴香作为调料与香辛料在食品加工及香料工业中被广泛应用；同时八角茴香作为一种药材,可用于治疗消化不良,神经衰弱等病症[12,13]。有研究发现八角茴香精油对医学和食品中的致病细菌具有较强的抑制作用[14]；八角茴香精油对于一些贮粮害虫也具有良好的灭杀和趋避作用[15,16]。同时,八角茴香油精对棉花枯萎病菌也表现出较明显的抑制作用[17],但有关八角茴香精油抑菌机理的报道相对较少。

本研究以苹果轮纹病为研究对象,筛选了17种植物试验其抑菌活性,并对效果最好的八角茴香中的主要活性成分反式茴香脑展开进一步研究,为新型植物源杀菌剂的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植物:分别为13个科17个种(表1)；

反式茴香脑:购自上海麦克林生化科技有限公司；

供试菌种:苹果轮纹病菌(Botryosphaeria),由山西农大植物病理系提供。

表1 供试植物样品Table 1 Test plant samples

1.2 方法

1.2.1 17种植物提取物对苹果轮纹病的抑制作用

采用菌丝生长速率法[18]进行抑菌活性测定。

1.2.2 八角茴香与博落回2种植物提取物对苹果轮纹病菌的抑制中浓度

针对苹果轮纹病菌,选取抑制效果最好的植物提取物,利用二倍稀释法[19]将八角茴香与博落回2种植物提取物配制成2、1、0.5、0.25、0.125 g·L-1共5个浓度并制作加药培养基,测定各浓度对应的抑菌率,统计分析得到不同植物提取物对病原菌的抑制中浓度。

1.2.3 反式茴香脑对苹果轮纹病菌的抑制中浓度

反式茴香脑为八角茴香提取物中的主要有效成分,利用二倍稀释法将反式茴香脑配制成成1、0.5、0.25、0.125、0.063 g·L-1共5个浓度并制作加药培养基,测定各浓度对应的抑菌率,统计分析得到反式茴香脑对苹果轮纹病菌的抑制中浓度。

1.2.4 反式茴香脑对苹果轮纹病菌菌丝体内可溶性蛋白含量的影响

采用考马斯亮蓝法测定[20]菌丝体内可溶性蛋白含量。

1.2.5 反式茴香脑对苹果轮纹病菌菌丝体内丙酮酸含量的影响

采用紫外分光光度法测定[21]菌丝体内丙酮酸含量。

1.2.6 反式茴香脑对苹果轮纹病菌菌丝体内还原糖含量的影响

采用DNS法测定[22]菌丝体内还原糖含量。

2 结果与分析

2.1 17种植物提取物对苹果轮纹病菌的抑制作用

通过对比分析,浓度为2 g·L-1时,八角茴香、博落回2种植物提取物对苹果轮纹病菌菌丝抑制率最好,96 h均无菌丝生长,达到了100%(图1)。17种植物提取物对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用见表2。

A：空白对照；B：八角茴香提取物；C:博落回提取物A:CK; B:Illicium verum extract; C：Macleaya cordata extrat图1 八角茴香与博落回提取物对苹果轮纹病菌菌丝生长抑制图Fig.1 Inhibition of the growth of apple ringworm mycelium by Illicium verum and Macleaya cordata

2.2 八角茴香与博落回2种植物提取物对苹果轮纹病原菌的抑制中浓度

运用DPS软件对96 h的数据进行统计分析,分别求出八角茴香、博落回2种植物提取物在处理苹果轮纹病菌后的毒力回归方程和抑制中浓度(EC50)(表3)。

由表3可知,在96 h下八角茴香与博落回提取物对苹果轮纹病病原菌的EC50分别为0.297 6、0.265 0 g·L-1,两者相比,八角茴香提取物的抑菌效果更好。

表2 17种植物提取物对苹果轮纹病菌菌丝的抑制作用Table 2 Inhibition of 17 plant extracts on the hyphae of Botryosphaeria

表3 八角茴香和博落回提取物在96 h对苹果轮纹病菌的毒力作用Table 3 The toxicity of extract from I.verum and M.cordata against Botryosphaeria at 96 h

2.3 反式茴香脑对苹果轮纹病原菌的抑制中浓度

运用DPS软件对48 h、72 h、96 h后的数据进行统计分析,分别求出反式茴香脑作用苹果轮纹病菌后的毒力回归方程和抑制中浓度(EC50)(表4)。由表可知,反式茴香脑对苹果轮纹病菌的抑菌作用与时间呈反比,时间越长抑菌作用逐渐减弱。

表4 反式茴香脑在不同时间对苹果轮纹病菌的毒力作用Table 4 The toxicity of extract from trans-Anethole against Botryosphaeria at different times

2.4 反式茴香脑对苹果轮纹病菌菌丝体内可溶性蛋白含量的影响

经反式茴香脑处理3 d后苹果轮纹病菌丝体内可溶性蛋白含量见表5。从表中可知,经反式茴香脑处理后菌丝体内的可溶性蛋白含量随着浓度的升高而降低。当反式茴香脑浓度为1 g·L-1时菌丝体内的可溶性蛋白含量最低,与CK相比在5%水平下存在显著性差异。当反式茴香脑浓度为0.063 g·L-1时菌丝体内的可溶性蛋白含量与CK相比几乎没有变化,在5%水平下无显著性差异。

表5 不同浓度处理下菌丝体内可溶性蛋白的含量

2.5 反式茴香脑对苹果轮纹病菌菌丝体内丙酮酸含量的影响

经反式茴香脑处理3 d后苹果轮纹病菌丝体内丙酮酸含量见表6。从表中可知,苹果轮纹病菌丝体经反式茴香脑处理后菌丝体内的丙酮酸含量随着其浓度的增大呈现下降的趋势。当反式茴香脑浓度为1 g·L-1与CK之间菌丝体内丙酮酸含量在5%水平下存在显著性差异。

2.6 反式茴香脑对苹果轮纹病菌菌丝体内还原糖含量的影响

经反式茴香脑处理3 d后供试菌菌丝体内还原糖含量见表7。从表中可知,经反式茴香脑处理的菌丝体内的还原糖都有减少,且反式茴香脑的浓度与还原糖的含量成反比。当浓度为0.5 g·L-1、1.0 g·L-1与CK之间菌丝体还原糖含量在5%水平下存在显著性差异,反式茴香脑浓度为0.063 g·L-1与CK之间菌体内还原糖含量上无显著性差异。

表7 不同浓度处理下菌丝体内还原糖的含量

3 讨论与结论

目前,已有学者研究了植物源杀菌剂对苹果轮纹病菌的抑制作用。如程永芳[23]、赵刚[24]、刘保友[25]等研究了对苹果轮纹病菌抑制效果明显的植物提取物,分别为5 g·L-1的黎芦乙醇提取物、50 g·L-1韭菜提取液和0.002 g·L-1丁子香酚,其抑制率为74.3%、100%、90%。本研究测定了17种植物提取物对苹果轮纹病菌的抑菌活性,结果表明处理浓度2 g·L-1,处理时间96 h时,八角茴香与博落回提取物对苹果轮纹病菌的抑制率均达到100%。分别对其进行毒力测定,八角茴香提取物对苹果轮纹病菌的抑菌作用更强,其EC50为0.265 0 g·L-1。

八角茴香挥发精油是从八角枝、叶、果实通过蒸馏法或萃取法进行提取的一种芳香精油,其常温呈无色至淡黄色液体,而低温时凝结为白色的晶体,气芳香,味辛甜[26]。郭勇[27]、李祖光[28]、阳小勇[29]等采用不同的提取方法均得到八角茴香挥发精油中的主要成分为反式茴香脑。本研究进一步对反式茴香脑对苹果轮纹病菌的抑菌作用进行了研究,结果表明该物质对病原菌的EC50为0.160 0 g·L-1,抑菌效果强于八角茴香提取物,结合前期试验结果表明该物质确实是八角茴香提取物中抑制苹果轮纹病菌的有效成分。

真菌的细胞膜与细胞壁是杀菌剂的重要靶位,植物源抑菌物质会破坏真菌细胞的细胞壁,增大细胞膜的通透性,从而导致细胞中的内含物外渗,病原菌的生长受到抑制[30]。曾志红等[31]发现枝孢霉菌菌丝细胞膜是丁香提取物重要的作用靶位。可溶性蛋白、还原糖、丙酮酸等是反映病菌菌丝体细胞壁和细胞膜受到外界刺激后生理变化的重要指标。可溶性蛋白是菌体细胞的重要渗透调节物质,是细胞生物膜的保护物质,可以提高细胞的保水能力。还原糖是菌体细胞内的主要能量物质,是构筑菌体结构的物质前体。丙酮酸是糖代谢途径的中间产物之一,在糖、脂肪、蛋白质这3大营养物质的代谢过程中起着中心作用。

本研究通过分光光度法研究反式茴香脑对苹果轮纹病菌的病菌菌体内可溶性蛋白、丙酮酸、还原糖的含量的影响,结果表明病原菌菌体内可溶性蛋白、丙酮酸、还原糖的含量随着反式茴香脑浓度的增大而有不同程度的降低。菌丝体内可溶性蛋白含量减少表现在两方面,其一可能是是反式茴香脑抑制供试菌体内蛋白质的合成,其二可能是反式茴香脑作用于菌体细胞膜导致菌体内可溶性蛋白外渗。还原糖含量减少,可能是反式茴香脑影响菌体的糖代谢途径使得还原糖合成受阻,同时导致丙酮酸合成受阻,丙酮酸含量减少；或是膜结构的变化导致还原糖外渗,导致最终菌体应能量供应不足而死亡。这些均表明反式茴香脑能通过干扰菌丝体的物质代谢从而阻止其正常的发育。

综上所述,反式茴香脑增大苹果轮纹病菌菌体细胞膜的渗透性,导致菌体内可溶性蛋白及还原糖外渗,或是抑制其菌体内物质的合成代谢,关于反式茴香脑对苹果轮纹病菌的具体作用靶点、代谢途径及信号通路等可采用转录组测序进一步研究。