美藤果叶提取羟基酪醇抑菌活性的研究①

（海南启星生物科技有限公司 海南三亚 572000）

天然植物特别是药用植物具有来源广泛，毒副作用相对较小等优点，其有效成分是作为制备食品防腐剂重要途径之一。陈忠等［1］研究发现，猪肚木茎氯仿提取物、血桐没食子酸粗提物、黄皮果核石油醚提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌具有明显的抑制作用，且血桐没食子酸粗提物对毛霉、黑曲霉生长也有抑制作用。猪肚木茎氯仿提取物、血桐没食子酸粗提物和黄皮果核石油醚提取物具有抗菌活性。罗思源等［2］研究发现，羟基酪醇对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌和枯草芽抱杆菌的MIC 分别为0.625、0.625、1.250、2.500 mg/mL，MBC 分别为1.250、1.250、2.500、5.000 mg/mL。与对照相比，4 种供试菌核酸和可溶性蛋白泄漏显著，细胞膜的完整性被破坏。在不同NaCl 浓度下，羟基酪醇对枯草芽抱杆菌的抑菌活性稳定；在1.0%、2.0%NaCl浓度下，羟基酪醇对大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌的抑菌活性稳定；在2.0%NaCl介质下，低浓度的径基酪醇对金黄色葡萄球菌的抑菌活性稳定；在0.5%、1.5%和2.0%NaCl 介质下，高浓度的羟基酪醇对金黄色葡萄球菌的抑菌活性稳定。在蔗糖介质中，羟基酪醇对4种供试菌的抑菌活性均不稳定。因此，羟基酪醇可以作为一种新型的防腐剂。

美藤果（Plukenetia volubilisLinneo）又名星油藤、印加果，2006 年从南美洲引进中国的油料作物［3］，因此本公司对美藤果叶进行了水提取羟基酪醇，并采用常规纸片扩散法测定美藤果叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌的抑制活性。本研究的目的是测定美藤果叶提取物的抑菌活性，为在食品工业中作为天然的防腐剂、防止食品的氧化变质提供参考，为筛选海南岛热带植物提取物作为食品防腐剂提供思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

羟基酪醇：由本公司从三亚产美藤果叶中提取；供试菌种：金黄色葡萄、大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌均购买上海鲁微科技有限公司；培养皿、接种环、接种针、培养箱、净化台、酒精灯、旋转蒸发仪、电子天平、高压灭菌锅、冷冻干燥机、净水机等。

1.2 方法

1.2.1 羟基酪醇含量的测定方法

样品前处理。参照易骏等［4］样品提取方法进行。具体操作如下：取三亚产美藤果叶中提取的羟基酪醇粉末0.500 0 g（精确至0.000 1 g），置具塞锥形瓶中，加入80%乙醇10 mL，密塞，定容，回流提取2 h，过滤，滤液用80%乙醇定容至50 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，稀释后上样。

检测条件。液质联用仪：UPLC -MS/MS［Waters uplc（l-class）；PDA 检测器；三重四级杆质谱Waters Xevo TQ -SMicrol］。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1X 50 mm）。流动相A：0.25%甲酸水；流动相B：0.25%甲酸甲醇溶液。流速：0.25 mL/min。进样量：2.0 μL。柱温：35C。PDA 检测：200～360 nm 连续扫描（截取265 nm 色谱图）。质谱扫描条件：ESl-模式，喷雾电压2.0 kV；锥孔电压30 V；脱溶剂温度500 ℃；脱溶剂气（N2）1 000 L/h。扫描范围：50～500 m/Z。梯度洗脱过程如表1。

表1 液质联用仪梯度洗脱过程

1.2.2 羟基酪醇的抑菌活性方法

称取营养琼脂放入三角烧瓶中，根据营养琼脂标签比例加水、琼脂，称取后用棉塞塞住三角烧杯瓶口，用纱布和包装纸包住、再用线绳捆好高压灭菌，灭菌后在无菌情况下倒入培养皿（薄薄一层）中做抑菌实验的培养基。

羟基酪醇在使用前按一定比例配制成0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.075 0、0.100 0、0.125 0、0.150 0、0.175 0 g/mL 浓度梯度的样品，于冰箱（0～4℃）储存备用［5］。用配好的不同浓度梯度的提取液浸透滤纸（d=6 mm），待其自然晾干后放入接有菌种的培养皿中，每个培养皿中放置几片滤纸（含羟基酪醇提取物），再放入空白滤纸片作对照（蘸取无菌水）。利用扩散作用，使滤纸的药品溶入培养基中［6-8］。细菌在经过24 h、37℃［9］，观察培养皿中有无抑菌圈，有抑菌圈的用尺子测量其抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 羟基酪醇含量检测

由表1可知，分别称取从三亚产美藤果叶中提取的羟基酪醇粉末0.500 6 和0.501 0 g，定容至10 mL，稀释100 倍，测定值分别为142.36 μg/mL和141.28 μg/mL，测定羟基酪醇含量为28.44%和28.20%。

2.2 羟基酪醇抑菌试验

两种培养基，一种是血平板，一种是琼脂培养基。图1～2为羟基酪醇对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌活性作用效果，抑菌圈为15～24 mm，空白对照无抑菌圈。

图1 羟基酪醇对金黄色葡萄球菌抑菌活性作用

2.3 羟基酪醇对供试细菌的抑菌效果

由表2 可知，羟基酪醇在浓度0.012 5、0.025、0.050 g/mL 对4 种供试细菌无抑菌效果，但浓度0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 g/mL对4 种供试细菌具有抑菌效果，羟基酪醇最低抑菌浓度为0.075 g/mL，最小抑菌直径为10.1 mm，最大为22.0 mm，空白对照均无抑菌效果。

图2 羟基酪醇对大肠杆菌抑菌活性作用

表2 羟基酪醇对供试细菌的抑菌效果

3 结论

大多数多酚类化合物具有抑菌活性，茶多酚［10］、黄酒多酚［11］、玉米须多酚［12］等。在抑菌活性研究中，多以多酚提取物为研究对象，而少有文献对组成多酚的单体进行抑菌活性研究。因此，笔者对美藤果叶提取羟基酪醇抑菌活性进行研究。

本实验结果表明，羟基酪醇具有较强的抑菌效果，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌和痢疾杆菌4 种供试菌种的最低抑菌浓度（MIC）为0.075 g/mL 抑菌圈分别为15.0、11.0、10.0、13.2 mm，最小杀菌浓度（MBC）为0.175 g/mL抑菌圈分别为22.0、21.7、18.0、20.9 mm。羟基酪醇对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌具有明显的抑制作用，为筛选海南岛热带植物提取物作为食品防腐剂提供思路和理论依据。

美藤果叶提取的羟基酪醇是一种天然多酚类化合物，水提后经冷冻干燥，对提取物测试，羟基酪醇含量为28.32%。美藤果叶提取羟基酪醇经抑菌试验对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌有较强的抑菌活性，其可以替代部分化学防腐剂用于食品防腐。因此，美藤果叶提取的羟基酪醇可作为一种天然的防腐剂用于食品防腐，防止食品的氧化变质具有广阔开发前景。