对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌生物学特性及侵染毒力的影响

赵静 常继东 郑丽君 王志远

摘要：明确对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌侵染毒力的影响，可为克服三七连作障碍提供有效的策略。结合荧光素二乙酸酯-碘化丙啶（FDA-PI）染色及马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板萌发法，分析不同浓度下对羟基苯甲酸与尖孢镰刀菌孢子活性的相关性;采用酶学法分析不同浓度下对羟基苯甲酸对真菌纖维素酶分泌的影响。FDA-PI染色结果表明，当对羟基苯甲酸浓度为5mmol/L时，尖孢镰刀菌产孢数量最多，孢子活性最强。PDA平板萌发测定结果显示，对羟基苯甲酸浓度为1mmol/L时，尖孢镰刀菌孢子的平均萌发率为58.05%，孢子萌发率最高。低浓度的对羟基苯甲酸胁迫下，尖孢镰刀菌分泌的纤维素酶活性增加，而高浓度下降低;对羟基苯甲酸浓度为5mmol/L时，纤维素酶活性最高，峰值出现在培养4d时，达到1.57U/mL，是相同时间下对照的5.6倍。研究表明，低浓度对羟基苯甲酸（1～5mmol/L）胁迫有利于尖孢镰刀菌孢子生长，且提高其分泌的纤维素酶活性。

关键词：对羟基苯甲酸;尖孢镰刀菌;孢子活性;纤维素酶

中图分类号：S182文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2020）22-0291-04

作者简介：赵静（1983—），女，云南玉溪人，博士，副教授，主要从事作物病虫害与防治研究。E-mail：hujun_maolv@163.com。

通信作者：王志远，博士，副教授，主要从事作物病虫害与防治研究。E-mail：yuan33441@sina.com。

三七根腐病是三七生产中的一类重要病害，不仅影响三七产量，更影响三七质量，其中以镰刀菌型根腐病最为多见[1]。在三七栽培中，随着连作年限的延长根腐病发病率明显增加[2]。根腐病的发生与连作条件下植物根系分泌物对病原菌的化感作用有密切关系。研究三七根系分泌物对病菌的化感致病性是解析连作条件下根腐病形成机制的有效途径。

在植物的生长发育过程中，根系作为植物与土壤的接触部分，不仅从土壤中吸收水分和养分，还通过分泌的方式向周围释放一些无机离子和有机化合物，这些物质是一类复杂的混合物，是植物连作对根际土壤微生物产生影响的重要媒介之一，参与植物与周围环境的物质交换与信号传递，是根际最为重要的营养和能量来源，也是构成植物不同根际微生态特征的关键因素[3-5]。对羟基苯甲酸为酚酸类化感物质，是自然界中常见的化合物，存在于高等植物、微生物、苔藓和土壤中。酚酸类物质是导致作物产生连作障碍的主要因素，它可以直接或间接地促进或抑制微生物生长，进而影响作物生长。Ren等研究了丛枝菌根定殖是否能缓解西瓜枯萎病，改变植物对病原菌的反应，结果表明，丛枝菌根的侵染抑制了西瓜根和根际病原菌的生长，使病害指数降低了89.3%，这是因为丛枝菌根的侵染改变了根系分泌物，抑制了西瓜枯萎病菌孢子的萌发[6]。郝文雅等以不同抗性西瓜品种以及化感水稻品种为试验对象，对其根系分泌物中可溶性糖和游离氨基酸的含量和组成进行分析，并研究了氨基酸对西瓜专化型尖孢镰刀菌生长的影响，结果表明，西瓜的根系分泌物能够促进镰刀菌孢子萌发和产孢，而水稻根系分泌物却具有反向作用[7]。

本研究拟探究对羟基苯甲酸胁迫下尖孢镰刀菌的生物学特性及致病毒力，以探明对羟基苯甲酸对尖孢镰刀菌的化感作用，以期为连作条件下根腐病的发生及病害防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验菌株及试验时间

尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）由云南农业大学植物病理学重点实验室惠赠。试验于2019年在玉溪师范学院分子生物学实验室进行。

1.2孢子活性的检测

1.2.1孢子悬浮液的制备

将尖孢镰刀菌菌株分别在含有1、5、10、50mmol/L对羟基苯甲酸的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中于26℃下振荡培养7d，以不添加对羟基苯甲酸的PDA培养基为对照（CK）。将培养好的病原菌孢子混合液依次用200目（孔径0.075mm）和300目（孔径0.048mm）筛网过滤，去除菌丝和培养基杂质。然后取30mL滤液于50mL离心管中，在5000r/min下离心5min，去上清液后以无菌水进行重悬并离心，重复2～3次。用磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH值为7.4）将孢子重悬。

1.2.2FDA-PI荧光染液的配制、染色及孢子死亡率的计算

荧光素二乙酸酯-碘化丙啶（FDA-PI）荧光染液的配制及染色参照柴阿丽等的方法[8]，尖孢镰刀菌孢子悬浮液染色后于荧光显微镜下观察，采用血细胞计数器根据孢子着色情况计算孢子死亡率。

1.3孢子萌发率的计算

制备对羟基苯甲酸浓度分别为1、5、10、50mmol/L的PDA培养基，以不添加对羟基苯甲酸的PCA培养基为对照（CK）。把灭过菌的微孔滤膜平铺在制备好的PDA平板上，使微孔滤膜平铺于培养基表面，把制备的孢子悬浮液平铺在滤膜上，用三角玻璃棒将菌悬液涂布均匀（每个平板涂布70μL菌悬液），用封口膜封口后置于28℃下培养，5～8h后制作玻片观察并记录孢子的萌发情况，每个处理重复3次，每个样本检查100个孢子，统计孢子萌发率。

1.4酶活性的测定

纤维素酶活性的测定采用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）法。

2结果与分析

2.1FDA-PI荧光染色效果观察和孢子死亡率的计算

尖孢镰刀菌新鲜孢子悬浮液利用FDA染液单染后，在荧光显微镜下，活孢子呈亮绿色荧光（图1-a）;经加热致死的孢子利用PI染液单染后，死孢子发出红色荧光（图1-b）。取1mL新鲜孢子悬浮液与1mL[JP+1]加热致死的孢子悬浮液混合均匀，经FDA-PI染液染色后，在荧光显微镜下可明显观察到发出红色荧光的死孢子和发出绿色荧光的活孢子（图1-c）。上述结果表明，采用FDA-PI染色方法能较好地对尖孢镰刀菌孢子的死活进行判断，其中活孢子呈绿色荧光，死亡孢子呈红色荧光。

[JP3]由表1可知，在不同浓度（0、1、5、10、50mmol/L）对羟基苯甲酸胁迫下，尖孢镰刀菌产孢数量有较大区别。其中，对羟基苯甲酸浓度为5mmol/L时产孢数量最多，经血细胞计数器检测得出，孢子数量为180万个/mL，其次为含1mmol/L对羟基苯甲酸的培养基，产孢数量为170万个/mL。对羟基苯甲酸浓度为50mmol/L时不产孢子。经FDA-PI双染后死孢子在荧光显微镜下呈红色，活孢子呈绿色。在0、1、5、10mmol/L对羟基苯甲酸胁迫下，尖孢镰刀菌孢子死亡率分别为79%、75%、64%、70%，悬浮液中孢子死亡个数分别为94.8万、127.5万、115.2万、56.0万个/mL。当对羟基苯甲酸浓度为5mmol/L时，尖孢镰刀菌产孢数量最多，经FDA-PI染色后，孢子存活率也最高。

2.2对羟基苯甲酸胁迫下尖孢镰刀菌孢子的萌发率

采用PDA平板法观察孢子的萌发情况，结果发现，在对羟基苯甲酸浓度为1、5mmol/L的培养基中，孢子萌发最早，萌发时间为5.5h。其次为对照，萌发时间为6h。对羟基苯甲酸浓度为10mmol/L时，萌发时间为11h，而羟基苯甲酸浓度为50mmol/L时，尖孢镰刀菌孢子无萌发。

由图2可知，不同浓度对羟基苯甲酸胁迫下，尖孢镰刀菌孢子的萌发率不同，其中CK组的平均萌发率为42.45%;对羟基苯甲酸浓度为1mmol/L时，孢子萌发率最高，平均萌发率为58.05%;对羟基苯甲酸浓度为5mmol/L时，孢子的萌发率低于浓度为1mmol/L时，平均萌发率为50.8%，对孢子的萌发仍有促进作用，但促进作用减缓;对羟基苯甲酸浓度为10mmol/L时，孢子萌发率低于空白对照组，平均萌发率为29.5%，对孢子的萌发开始有抑制作用;当对羟基苯甲酸浓度50mmol/L时，完全抑制孢子的萌发，孢子平均萌发率为0。

2.3对羟基苯甲酸胁迫下纤维素酶活性的变化

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素和壁蛋白等组成。其中，纤维素是构成细胞壁的骨架物质[9]。植物细胞壁是植物健康的保障，病原菌可以通过入侵植物细胞壁，分泌细胞壁降解酶使植物受到侵染而感病[10]。因此，细胞壁降解酶是病原菌侵染寄主组织的主要致病因子之一[11]。由图3可知，在低浓度的对羟基苯甲酸胁迫下，尖孢镰刀菌分泌的纤维素酶活性增加，而高浓度下降低。对羟基苯甲酸浓度为5mmol/L时，纤维素酶活性最高，峰值出现在培养4d时，达到1.57U/mL，是相同时间下对照的5.6倍。由此可以得知，低浓度对羟基苯甲酸有利于尖孢镰刀菌入侵植物组织。

3讨论

研究表明，酚酸类物质是导致作物产生连作障碍的主要因素，它可以直接或间接地促进或抑制微生物生长，进而影响作物生长[12]。马燕会等通过盆栽试验及高效液相色谱（HPLC）技术发现，对羟基苯甲酸可增加根系分泌物中对镰刀菌生长具有促进作用的氨基酸种类和含量[13]。甄文超等研究发现，对羟基苯甲酸可提高草莓根际镰刀菌的数量，致使根际微生物组成由“细菌型”向“真菌型”转变[14]。在前期研究中，笔者已明确从三七重茬土壤中提取到的29种化感物质对尖孢镰刀菌具有明显的化感作用[15]。本研究中，对羟基苯甲酸在低浓度下可增加孢子产孢活性，促进孢子的萌发，最适宜的浓度为5mmol/L，该浓度下，尖孢镰刀菌产孢数量最高，且通过FDA和PI双荧光复染法检测得出，孢子存活率最高，死亡率最低，另外在该浓度下尖孢镰刀菌分泌的纤维素酶活性也最高。

荧光素二乙酸酯（fluoresceindiacetate，FDA）可以自由通过细胞膜，被非特异性酯酶分解产生荧光素，并积蓄在活细胞内产生荧光[16]。碘化丙啶（propidiumiodide，PI）不能透过完整的细胞膜，但能够透过死细胞的细胞膜而使细胞核被染红[16]。本研究中，在对羟基苯甲酸胁迫下，利用FDA-PI染色及PDA平板萌发法检测孢子活性，发现在相同浓度对羟基苯甲酸胁迫下，PDA平板萌发法测定的孢子活性更强。如当对羟基苯甲酸浓度为5mmol/L时，PDA平板萌发法测得的孢子平均萌发率为50.8%;而通过FDA-PI染色法得出，活孢子比例为37%，远低于平板萌发法。这说明FDA-PI染色剂对孢子活性具有一定的抑制作用，但相较于PDA平板萌发法方便、快捷。

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