产L-蛋氨酸基因工程菌株的构建

汤玥 何浩波 何凯 陈馨茹 胡翠英 姚雪梅 李良智

摘要：以野生型蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）EN34为出发菌株，增强胱硫醚γ-合成酶基因（metI）表达，敲除或弱化腺苷蛋氨酸合成酶的编码基因metK，分析这2个基因的改变对蛋氨酸产量的影响。从枯草芽孢杆菌基因组中扩增P43强启动子，连接到pEB03质粒，利用重组连接的方法，将metI从BacilluscereusEN34[JP2]扩增重组连接到质粒，构建成pEB03-P43-SD-metI，通过电击转化到BacilluscereusEN34，获得BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）菌株。通过BacilluscereusEN34扩增metK基因，提取质粒pKVM1以及重组连接等方法，构建出pKVM1：：metK′敲除质粒，[JP2]将质粒电转化到BacilluscereusEN34中进行metK交换，再筛选出单交换成功的菌株，最后获得metK弱化成功BacilluscereusEN34Δ（metK）菌株。经发酵培养基硫源优化分析得出，单独增强metI表达不能提高蛋氨酸产量，产量与出发菌株基本一致;改变metK基因，能提高蛋氨酸产量，但不能完全删除metK基因，否则将导致细胞死亡。硫源采用200μL/L甲基硫醇钠和二甲基硫醚的混合物（体积比19∶1）、15g/L的Na2SO4，二者结合，BacilluscereusEN34Δ（metK）菌株蛋氨酸产量为440.66mg/L，是出发菌株的20倍。本研究为芽孢杆菌工程菌的构建了提供一定的技术支持。

关键词：L-蛋氨酸;基因工程;芽孢杆菌;metI基因;蛋氨酸产量

中图分类号：S188文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2020）22-0037-07

作者简介：汤玥（1999—），女，江苏扬州人，主要从事发酵工程方面的研究。E-mail：1430701525@qq.com。

通信作者：胡翠英，硕士，高级实验师，主要从事发酵工程方面的研究。E-mail：13151170848@163.com。

蛋氨酸作为必需氨基酸之一，是动物饲料中必不可少的添加剂。产乳牛食用保护性蛋氨酸[1-2]，可以改善肉牛瘤胃内环境，提高产奶量[3-4];喂食产蛋鸡或肉仔鸡保护性蛋氨酸能提高产蛋能力和肉质[5-6];长期添加OH-蛋氨酸能改善猪肉嫩度[7]。现有全球制备蛋氨酸的方法主要是化学法[8]，发酵法制备蛋氨酸相对安全，但产量较低[9-11]。目前，笔者所在实验室已筛选到1株蜡样芽孢杆菌（BacilluscereusEN34），但由于代谢通路中复杂的调控机制，蛋氨酸产量难以提高。胱硫醚γ-合成酶是由metI基因（早期称yjcI基因）编码，它有2个功能[12-14]，一是为硫酸盐存在时，催化H2S与琥珀酰高丝氨酸反应形成L-高半胱氨酸;二是催化O-琥珀酰高丝氨酸生成胱硫醚。通过加强metI基因的表达，促进胞外S元素的消化吸收，可以提高蛋氨酸产量。S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶（由metK基因编码）催化蛋氨酸变成SAM[15-16]，是蛋氨酸重要代谢途径，阻断或减弱此途径，理想状态下能有效截留L-蛋氨酸，从而提高蛋氨酸产量。目前，针对蜡样芽孢杆菌这2个基因的改变研究较少，鉴于此，本研究以Bacillussp.EN34为出发菌株，通过基因工程的方法，增强胱硫醚γ-合成酶的表达量以及减弱或阻断SAM合成酶，以提高蛋氨酸产量。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株和质粒蜡样芽孢杆菌EN34（BacilluscereusEN34）为笔者所在实验室筛选保存菌株。质粒pEB03、pKVM1，以及感受态细胞S17-1均为笔者所在实验室保存。

1.1.2主要试剂和仪器质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、基因组DNA小量抽提试剂盒（离心柱式）等均购自天根生化科技（北京）有限公司;DNAMarker250bpⅠ、Ⅱ、Ⅲ均购自上海捷瑞生物工程有限公司;EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ均购自北京全式金生物技术有限公司;T4连接酶购自基因生物技术国际贸易（上海）有限公司;重组酶ClonExpressⅡ购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;氯霉素、氨芐青霉素、红霉素等抗生素均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，使用浓度分别为25、100、10μg/mL。氨基酸含量分析所用试剂、培养基成分均购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器有电泳仪（Subcell德国Eppendorf公司），凝胶成像分析仪（GelDocXR+美国Bio-Rad公司），全波长紫外分光光度计（NanoDrop2000美国ThermoElectron公司），细胞电穿孔仪（ECM630美国BTX公司），氨基酸分析仪（A300德国MembraPure公司），聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（5332德国Eppendorf公司）等。

1.1.3培养基[JP2]LB培养基（1L）：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，pH值为7.0;种子液（1L）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH值为7.2;发酵培养基（1L）：葡萄糖110g，尿素8g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.2g，FeSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O02g，（NH4）2SO42g，生物素5μg/100mL，硫胺素200μg/100mL，Na2SO415g，pH值为6.5。

1.2PCR引物设计

利用KEGGPathway网站与MEGA5分析metK和metI基因保守序列，利用NCBI数据库设置3对引物（metIF/R、metK[STBX]1[STBZ]F/R、metK[STBX]2[STBZ]F/R），用于扩增EN34菌株相应的基因，然后测序。根据测序结果，设置引物metI-F（含EcoRⅠ与P43部分序列）、metI-R（含BamHⅠ与部分pEB03上面的序列）、metKUF（含pKVM1质粒上部分序列、EcoRⅠ序列）、metKUR（含metK下游部分序列）、metKDF（含metK前面部分序列）、metKDR（含pKVM1质粒上部分序列、EcoRⅠ序列）。P43强启动子来源于枯草芽孢杆菌，依据NCBI数据库，设置P43引物P43F（含HindⅢ序列）与P43R（含EcoRⅠ和SD序列）。扩增基因的引物名称和具体引物序列见表1。

1.3metI基因加强表达

metI基因加强表达的操作流程如图1所示。（1）获得metI擴增产物。接种EN34菌株于种子液，30℃培养过夜，用液氮碾磨菌体，提取总DNA。用metIF/R引物扩增metI基因并测序。（2）构建pEB03+P43+SD质粒。获取枯草芽孢杆菌基因组，用P43F/R引物（带SD序列）扩增P43强启动子，获得P43-SD产物。用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切pEB03质粒，连接P43-SD。转化连接产物到S17-1感受态细胞，挑取转化子，用引物P43F与P43R验证，获得含pEB03-P43-SD质粒的S17-1。（3）pEB03-P43-SD-metI表达质粒的构建。用BamHⅠ酶切pEB03-P43-SD质粒，将酶切产物用Exnase酶重组连接metI基因扩增产物（用metI-F/R扩增）。重组连接产物转化到S17-1感受态细胞，挑取转化子，利用metI-F/R验证metI基因序列，获得含pEB03-P43-SD-metI质粒S17-1细胞。（4）电击转化与验证。将pEB03-P43-SD-metI质粒电击转化到Bacillussp.EN34感受态细胞中[17]。电击转化条件：电容25μF，电阻200Ω，脉冲电压2500V/cm，约4.5ms/次脉冲。向电击液中加入LB培养基，30℃静置2h，涂布LB平板（含氯霉素），30℃培养24～36h;[JP2]用引物P43F/R验证是否有P43强启动子。将获得的菌株命名为BacilluscereusEN34pEB03-P43-SD-metI。

1.4metK基因敲除

metK基因敲除流程见图2。（1）扩增EN34菌株中metK。因metK较长，分成2部分扩增，中间重叠。利用引物metK1F/R、metK2F/R扩增metK基因，测序。（2）分别扩增metK上下游部分序列，如图2中metKU（格子）与metKD（点）片段，引物为metKUF/R、metKDF/R。（3）pKVM1：：metK′的构建。重组连接pKVM1的EcoRⅠ酶切产物与metK上下游部分序列。将连接产物转化到S17-1感受态细胞中。挑取在氨苄LB平板上长出的菌落。以metKUF/R为引物验证是否含有metK′基因。（4）pKVM1：：metK′质粒电击转化EN34菌株。方法同“1.3”节。涂布平板[含安苄（Amp）、异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）];30℃培养24～36h;挑出蓝色菌株到新的LB培养基中，过夜培养。（5）单交换转化子。将培养液接种至LB培养基（含Amp、SAM、IPTG和X-gal）中，30℃培养6～12h，转接至新鲜LB培养基中，42℃培养6～12h，系列稀释（10-4和10-5）至含葡萄糖的营养肉汤固体培养基平板（含氨苄、SAM、IPTG和X-gal），42℃过夜培养，挑取转化子，非蓝色菌落，在42℃LB培养基中培养16h，以metKUF与metKDR为引物验证单交换转化子。（6）双交换转化子。挑取转化子至LB液体培养基（含SAM）中，30℃（无抗性）培养并转接两代，稀释涂LB平板，30℃培养，挑取转化子，并进行分子验证（双交换）。将获得的菌株命名为BacilluscereusEN34Δ（metK）。

1.5蛋氨酸产量分析

分别接种BacilluscereusEN34、BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）、BacilluscereusEN34Δ（metK）到种子液，过夜培养，接种到发酵培养基，向培养BacilluscereusEN34Δ（metK）的发酵培养基中加入10mg/LSAM，下同。30℃200r/min摇床培养72h。发酵液10000r/min离心10min，取400μL上清液样品，加入100μL10%的磺基水杨酸，2～8℃静置60min。14500r/min离心5min，用0.22μm针式过滤器过滤，得到的样品用氨基酸分析仪分析。每种菌平行3次试验。

1.6优化培养基成分

BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）增加metI表达，metI催化反应之一是加速Na2SO4向蛋氨酸的转化，针对此菌的优化项是改变培养基中Na2SO4的含量。发酵培养基中其他成分不变，Na2SO4浓度梯度为5、10、15、20、25、30、35、45g/L。

BacilluscereusEN34Δ（metK）蛋氨酸相对产量较高，对培养条件也做了2种硫源的优化。发酵培养基中其他成分不变，Na2SO4浓度梯度为5、10、15、20、25g/L。向发酵培养基中梯度添加甲基硫醇钠和二甲基硫醚的混合物，二者体积比为19∶1，替换发酵培养基中Na2SO4。混合物的添加浓度分别为200、250、300、350、400μL/L。

最后，在最优条件下，同时培养3种菌株。

2结果与分析

2.1质粒pEB03-P43-SD-metI构建

以BacilluscereusEN34基因组为模板，扩增metI，电泳分析得出，片段大小为1113bp。以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，扩增P43强启动子，经10%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，扩增片段大小约为450bp（含SD序列）。用T4连接酶连接pEB03质粒酶切产物与P43-SD，对连接成功的菌株提取质粒pEB03-P43-SD，重组连接此质粒酶切产物与metI片段，转化S17-1感受态细胞后挑取菌落，培养，电泳分析结果（图3）表明，在选取的13个菌株中，有2个菌株（8号和11号）中获得metI序列，片段大小与预期一致，约1000bp。证明质粒pEB03-P43-SD-metI构建成功。

2.2电击转化质粒pEB03-P43-SD-metI

将质粒pEB03-P43-SD-metI电击转化到BacilluscereusEN34感受態细胞后，挑取获得的菌株，利用PCR法验证是否有P43强启动子（大约400bp）。经电泳分析，获得8株转化成功的菌株，为与出发菌株对照，分析了检验转化成功的1株菌株、出发菌株、质粒pEB03-P43-SD-metIP43序列扩增电泳图，结果见图4。由图4可知，出发菌株没有扩增出P43序列，而转化成功的菌株与质粒pEB03-P43-SD-metI的P43扩增成功，在约450bp处均有明显的条带。

2.3构建质粒pKVM1：：metK′

以BacilluscereusEN34基因组为模板，metK1F/R、metK2F/R为引物扩增出metK基因完整序列，经测序分析，全长约1095bp。用引物metKUF/R、metKDF/R扩增相应片段，2个片段大小均约为300bp。2个片段重组连接后命名为metK′，大小约为600bp。将pKVM1酶切产物与2个片段重组连接，形成pKVM1：：metK′，转化感受态细胞S17-1。经验证，质粒pKVM1：：metK′中含有metK′，说明质粒构建成功，见图5中8号样品电泳结果。

2.4改变BacilluscereusEN34metK基因

提取质粒pKVM1：：metK′，电击转化到BacilluscereusEN34感受态细胞中。电转化后涂布含有Amp、IPTG、X-gal的平板中。质粒pKVM1上含有β-半乳糖苷酶基因，并含有Amp抗性，因此电转化成功的转化子在X-gal存在的情况下能够显蓝色。挑选5株蓝色转化子进行单交换培养，挑取白色菌落。质粒pKVM1上带有的Amp抗性，即使发生单交换，其Amp抗性仍存在（BacilluscereusEN34原始菌无Amp抗性）。如果质粒与基因组没有发生重组，菌落显示蓝色，只有白色菌落有可能发生同源重组[18]。进行双交换试验，没有菌株生长在LB平板上，说明发生双交换，SAM无法合成，即使补充适量SAM，菌体也会死亡，所以最终只能获得单交换的菌株，单交换仅仅是弱化了metK基因[19]。

以metKUF/R为引物，不同菌株的电泳结果如图5所示。选取的5株菌中均含有重组后的metK′基因（约600bp）和约1700bp较弱的metK完整基因，比7号泳道中BacilluscereusEN34扩增的片段稍大，应该是metK-metK′结构。电泳图中2～6号菌株中出现更大的片段，应该有质粒插入到metK基因中，质粒大小约为11000bp。

2.5蛋氨酸产量分析

将BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）、BacilluscereusEN34Δ（metK）、BacilluscereusEN34均接种到完全培养基，过夜培养后接种到发酵培养基。培养72h后，利用氨基酸分析仪分析发酵液中蛋氨酸产量（图6）。BacilluscereusEN34发酵液中蛋氨酸产量平均值为38.89mg/L，BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）产量平均值为29.46mg/L。说明虽然metI基因增加了拷贝数，但蛋氨酸产量并没有提高。原因可能是发酵培养基中硫源的量不足，也可能是拷贝数增加了，但表达量还未提高。BacilluscereusEN34Δ（metK）产量平均值为79.58mg/L。

2.6培养条件优化

针对BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）菌株，梯度添加不同浓度的Na2SO4后，蛋氨酸产量有明显上升（图7），当Na2SO4添加量达到15g/L时，蛋氨酸产量达到最大值。由数据计算结果可知，此时蛋氨酸产量达26.53mg/L，与“2.5”节中结果一致。说明增加有强启动子P43的表达质粒，没有强化硫酸钠的代谢通路，须要进一步加强表达整个通路中的其他酶。Na2SO4浓度高于15g/L时蛋氨酸产量变化不大，因此Na2SO4最佳添加量为15g/L。图8展现的是Na2SO4对BacilluscereusEN34Δ（metK）菌株的影响，当Na2SO4添加浓度达到15g/L时，蛋氨酸产量达到最大值，为151.8mg/L。

如图9所示，梯度添加甲基硫醇钠和二甲基硫醚混合物，添加量从0到200μL/L，蛋氨酸产量迅速增加。添加量从200到350μL/L，蛋氨酸产量上升幅度极小，因此此混合物添加量选择200μL/L，此时蛋氨酸产量为159.5mg/L。甲基硫醇钠的利用，需要一定比例的二甲基硫醚配合才能发挥它的作用。甲基硫醇钠在发酵过程中，主要提供硫源和甲基源[20]。

在优化试验中，将2类硫源都加入到发酵培养基中，即200μL甲基硫醇钠和二甲基硫醚的混合物、15g/L的Na2SO4。蛋氨酸产量如图10所示，[JP2]BacilluscereusEN34出发菌株的产量为22.24mg/L，metK基因表达弱化的菌株产量为440.66mg/L，相当于出发菌株的20倍。进一步说明metK基因缺失或表达弱化阻止了蛋氨酸向S-腺苷蛋氨酸的转变，增加了蛋氨酸产量。而BacilluscereusEN34（pEB03-P43-SD-metI）菌株蛋氨酸[JP2]产量反而更低，进一步证明metI单独增强，不会提高蛋氨酸产量。

3讨论

BacilluscereusEN34是在实验室筛选获得的一株野生型菌株，产少量蛋氨酸。蛋氨酸代谢通路复杂，存在较多反馈抑制，为提高蛋氨酸产量，本试验从2个方向分析，改变metI、metK2个基因对蛋氨酸产量的影响[21]。加强MetI催化向蛋氨酸的反应，减弱或阻止metK催化蛋氨酸向SAM的转化。加强metI，采用导入表达质粒pEB03，连接强启动子P43。P43来源于枯草芽孢杆菌，与BacilluscereusEN34同属于芽孢杆菌，易于强化所连接基因的表达。马磊等增强启动子P43构建了pYG43穿梭表达载体，成功提高了宿主体内碱性纤维素酶活性的5～7倍[22]。本次试验，如果pEB03-P43-SD-metI转化到BacilluscereusEN34中能提高蛋氨酸产量，后期可设计试验重组质粒上的P43强启动子到BacilluscereusEN34基因组metI基因前面，再去除质粒。此次试验是对加强metI基因对蛋氨酸产量的影响探索。但本试验结果说明，单独加强metI的表达，不能提高蛋氨酸产量。减弱或阻止metK的表达，采用改变metK基因，试验顺利构建成穿梭性质粒pKVM1：：metK′载体，并转化到BacilluscereusEN34。双交换未获得，这与文献[19]中报道的一致，双交换彻底破坏了metK，无法合成SAM，导致细胞无法生长。试验中为弥补这一现象，培养基中补充适量的SAM，但菌体仍然无法生长。说明metK的表达只能弱化，不能删除。metK′与metK的重组，导致metK基因序列发生改变，对于其表达产物也会产生影响，理解为弱化表达，试验结果表明metK的弱化有利于蛋氨酸的积累。

甲基硫醇钠和二甲基硫醚都是还原性硫源，可以在代谢通路中直接转为O-乙酰高丝氨酸，通过O-乙酰高丝氨酸巯基酶（MetY）催化O-乙酰高丝氨酸生成蛋氨酸[20]。Na2SO4进入细胞后经一系列反应[21]，生成H2S，再经metI催化与琥珀酰高丝氨酸反应形成L-高半胱氨酸，最终转为蛋氨酸。相当于前者是直接硫源，后者是间接硫源。试验结果表明，2种硫源同时加入，有利于提高蛋氨酸产量。

4结论

本试验通过构建表达载体质粒pEB03-P43-SD-metI、穿梭质粒pKVM1：：metK′，电转化等流程，成功将metI基因与强启动子P43连接到表达质粒pEB03中，并转化到BacilluscereusEN34，使metI表达加强;另成功将metK部分基因插入到穿梭质粒pKVM1中，转化到BacilluscereusEN34发生重组，弱化metK的表达。通过优化培养基硫源，得出最佳硫源为2种：200μL/L甲基硫醇钠和二甲基硫醚的混合物、15g/L的Na2SO4。试验也确定单独增强metI基因不能提高蛋氨酸产量，而改变metK基因可以增加蛋氨酸产量，但不能完全去除metK基因，会导致菌株死亡。本试验结果可以为后期继续改造芽孢杆菌与提高蛋氨酸产量提供技术支持和数据参考。

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