一株乳酸菌的分离鉴定及在苹果汁发酵中的应用

潘勇 李建宋 赵思洁 廖祥儒 郝之奎

摘要：从苹果树根际土壤中筛选获得一株产酸菌株，经形态学和生理生化特征结合分子生物学研究，鉴定为植物乳杆菌，命名为LactobacillusplantrumasZ;以苹果为原料，将乳酸菌LactobacillusplantrumasZ应用于苹果汁发酵，通过单因素和正交试验，初步确定发酵苹果汁的最佳工艺条件为在苹果汁含量为35%、接种量为5%、蜂蜜添加量为2%、30℃发酵5d的条件下，苹果汁的感官评分达到91分，发酵苹果汁中总氨基酸和乳酸含量明显增加，总SOD活性和总黄酮含量分别增加80.0%和16.9%，维生素C含量保持在80%以上。

关键词：乳酸菌;鉴定;苹果汁;发酵

中图分类号：S182文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2020）22-0202-05

作者简介：潘勇（1992─），男，浙江丽水人，技术员，从事生物技术研究。E-mail：594696010@qq.com。

通信作者：郝之奎，博士，副教授，研究方向为微生物及生物质资源开发与利用。E-mail：haozhikui123@126.com。

苹果是日常生活中的第一大水果，因味美且富含微量元素、维生素、果胶、类黄酮及苹果多酚等营养或活性物质而深受大众喜爱[1]。我国是世界最大苹果种植国和产量国，年产苹果4388余万t[2]，与其他果品产业一样，以鲜销为主，深加工类品种单一，加工量占总产量比率低，产业水平和效益不高[3]。利用我国丰富的苹果资源开展深加工研究，是提高苹果产业效益和水平、增加苹果附加值、丰富市场、满足人民群众需要的重要途径。

乳酸菌是与人类可共存的一类有益微生物，大多存在于人体消化道内，对维持人体微生态平衡、提高人体免疫力起着重要作用[4]。随着对乳酸菌的研究深入，其价值得到充分挖掘。日常生活所用的食材如豆制品、肉制品、果蔬等都可用于乳酸发酵基质，乳酸发酵对改良食品风味、提高营养价值有着重要作用，在食品发酵工业领域，乳酸已得到广泛应用[5]。

本研究从苹果树根际土壤采集土样，利用加入溴甲酚紫指示剂的MRS培养基筛选产酸菌株，经形态和生理生化特征研究及分子生物学鉴定，将筛选的乳酸菌应用于苹果汁发酵，通过工艺优化研究苹果汁口感和营养成分变化，初步探索乳酸菌在制造苹果汁发酵饮料中的应用。

1材料与方法

1.1材料与仪器

试验于2017年11月至2018年4月在江南大学生物工程学院廖祥儒教授实验室进行。试验用苹果根际土壤取自烟台某苹果园;样本苹果为市售鲜果;常用食品级麦芽糖、柠檬酸氢二铵等培养基添加试剂;T-SOD试剂盒和细菌基因组提取试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

所用设备为普通实验室常用设备，分别为高效液相色谱仪[Agilent1260（安捷伦）]、高速离心喷雾干燥机（GEANiro）。

1.2培养基

试验培养基主要是乳酸细菌培养基（MRS培养基）、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、多价蛋白胨-酵母膏培养基（PY培养基）。

1.3试验方法

1.3.1菌株筛选

在MRS液体培养基中添加乳酸并调节pH值为5.5，加入适量土壤样本，30℃恒温摇床中低速培养14～18h，用灭菌水稀释104倍、105倍、106倍，分别取100μL均匀稀释液涂布于含有0.15%溴甲酚紫的MRS固体培养基平板上，倒置并在30℃条件下培养至形成菌落，挑选变黄菌落划线纯化至获得纯培养。

1.3.2菌株鉴定

1.3.2.1[JP3]菌株形态学观察观察研究30℃培养条件下形成的菌落特征和显微形态学特征（革兰氏染色）。

1.3.2.2菌株生理生化特征依据文献[6-8]的方法研究所获纯培养的糖利用、产酸产气、耐盐、耐乙醇及七叶苷水解等生理生化特性。

1.3.2.3菌株16SrRNA基因序列分析利用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增纯培养基因组，3%琼脂糖电泳检测并回收PCR扩增产物后测序（华大基因科技股份有限公司）。利用数据库http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov，BLAST程序分析同源性并初步鉴定。

1.3.3菌株生长特性研究

1.3.3.1最适生长温度的测定利用MRS培养基，5%接种量，设20、25、30、35、40℃等5个温度梯度，60r/min摇床培养24h，采样后测生物量（在600nm处测定吸光度D600nm），3个平行试验，结果取平均值。

1.3.3.2最适生长pH值的测定

利用MRS培养基，5%接种量，设4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8等9个pH值梯度，60r/min摇床培养24h，采样后测生物量（在600nm处测定D600nm），3个平行试验，结果取平均值。

1.3.3.3生长曲线和产酸能力的测定

利用MRS培养基，设5%接种量，60r/min摇床30℃培养，间隔2h采样测定D600nm，研究所获得纯培养的生长和产酸特性[9]。

1.3.4菌株在苹果汁发酵饮料中的初步应用

1.3.4.1发酵剂的制备把活化好的菌株按5%的接种量接种到MRS∶苹果汁分别为4∶1、3∶2、2∶3、1∶4等4种比例的发酵培养基，60r/min摇床30℃培养24h，分别转接至含1%蜂蜜的苹果汁中30℃发酵，24h后得苹果汁发酵剂。

1.3.4.2乳酸菌发酵苹果汁饮料工艺流程

乳酸菌發酵苹果汁饮料工艺流程为新鲜苹果→清洗、去皮、去核→榨汁→护色（0.2%柠檬酸水）→灭菌（75℃，5min）→冷却→加纯净水（苹果汁含量30%）→加2%的蜂蜜→接入发酵剂（接种量5%）→静止发酵（30℃，5d，起始pH值=7.0）→过滤→成品。

1.3.4.3苹果汁发酵条件的优化（1）单因素试验：依据“1.3.3.1”节试验结果确定温度，依据“1.3.4.2”节工艺，其他条件不变，接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%、11%，以感官评分为指标对个样本进行评价。依据“1.3.3.1”节试验结果确定温度，依据“1.3.4.2”节工艺，其他条件不变，苹果汁含量分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%，以感官评分为指标对个样本进行评价。依据“1.3.3.1”节试验结果确定温度，依据“1.3.4.2”节工艺，其他条件不变，蜂蜜添加量分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%，以感官评分为指标对个样本进行评价。

（2）正交试验：以接种量、蜂蜜添加量和苹果汁含量为三因素，感官评分为指标，设计L9（33）正交试验（表1），研究最佳发酵工艺条件。

1.3.4.4感官评定参考国标感官评定相关方法，随机组织20位有感官评价经验的人员从色、气、味等设计评价标准（表2），取平均值作为结果。

1.3.4.5苹果汁发酵前后主要成分的变化（1）氨基酸和有机酸含量测定：在最优发酵工艺条件下发酵苹果汁，发酵前后氨基酸含量和有机酸（苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸）含量用高效液相色谱法测定[10]。

（2）总SOD活性、总黄酮含量和维生素C含量的测定：苹果汁发酵前后采样并制备10%的匀浆液，4000r/min离心10min，取上清液测总SOD活性;据GB/T12143—2008《饮料通用分析方法》附录G的方法测定总黄酮含量;采用紫外分光光度法[11]测维生素C含量。样品均重复3次取平均值。

2结果与分析

2.1菌株鉴定

2.1.1菌株形态特征

筛选获得的纯培养菌落大小悬殊，直径为1～2mm，淡黄色，不透明，球形，边缘整齐，中凸起，表面光滑，革兰氏阳性（图1）。

2.1.2生理生化特性参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步鉴定所获纯培养为植物乳杆菌属（表3）。

2.1.3分子生物学研究

利用PCR仪扩增纯培养基因组，由图2可知，片段长度为1500bp左右，拖尾不明显。测序后通过BLAST，与Lactobacillusplantarum的同源性可达99%。结合生理生化研究结果，初步确定该纯培养为植物乳杆菌，并命名为LactobacillusplantrumasZ。

2.2LactobacillusplantrumasZ生长特性

2.2.1asZ的最适生长温度及最适pH值最适温度和最适pH值研究结果分别是30℃和6.5（图3、图4）。

2.2.2菌株生长曲线和产酸能力的测定

由图5可知，asZ的停滞期在0～4h，对数生长期在4～12h，此阶段D600nm值从0.1达到2.0，12h后进入稳定期。由图6可知，asZ产酸能力强，发酵10h，pH值由6.5降至3.8，对数期产酸较为明显。

2.3菌株LactobacillusplantrumasZ在苹果汁发酵饮料中的应用

2.3.1苹果汁发酵条件的优化

2.3.1.1单因素试验（1）苹果汁含量对发酵果汁感官的影响：将灭菌后的苹果汁加纯净水分别配制成20%、30%、40%、50%、60%、70%含量的苹果汁，再添加2%蜂蜜，起始pH值为7.0，接种量为5%，在30℃条件下发酵5d。由图7可知，当苹果汁含量38%时，其感官评分最高，故苹果汁含量以35%、40%、45%作为正交试验的3个水平。

（2）接种量对发酵苹果汁感官的影响：适当提高接种量可以缩短微生物生长的延滞期，缩短发酵时间，由图8可知，感官评分随着接种量的增大呈现出先增高后降低的趋势。当接种量理论值达到5.2%时，感官评分达到最高值87分，故以4%、5%、6%的接种量作为正交试验的3个水平。

（3）蜂蜜添加量对发酵苹果汁感官的影响：蜂蜜添加过少或过多会影响发酵饮料的酸甜感，如图9所示，感官分值似乎有2个峰值，结合产业化成本因素，选择1%、2%和3%的蜂蜜添加量作为正交试验的3个水平。

2.3.1.2正交试验

由表4可知，接种量对感官影响最大，苹果汁含量次之，蜂蜜添加量影响最小，最佳培养条件为A1B2C2，即苹果汁含量为35%，接种量为5%，蜂蜜添加量为2%，此时感官评分达到91分。

2.3.2苹果汁发酵前后主要成分的变化

2.3.2.1氨基酸含量的变化发酵对总氨基酸含量变化影响明显，发酵后总氨基酸提高了762.7%，其中脯氨酸提高最为明显，达5946.7%，精氨酸增加3427.9%。只有亮氨酸比發酵前降低7.2%（表5）。

2.3.2.2有机酸含量的变化

由图10可知，柠檬酸含量变化不大，苹果酸含量下降明显，发酵后有微量的乙酸产生，乳酸含量明显增加，从发酵前的0.32mg/100mL增长到496.87mg/100mL，增长了1551.7倍。

[FK（W10][TPPY10.tif][

2.3.2.3总SOD活性、总黄酮含量和维生素C含量的测定

由表6可知，发酵后总SOD活性和总黄酮含量分别增加80.0%和16.9%，维生素C的含量有所减少，但保留80%，可能原因是发酵形成了低pH值环境维生素C，损失的维生素C可能作为底物利用。

3结论

生物技术的发展极大地拓宽了乳酸菌的应用领域，也为传统水果的深加工提供了强大的技术支撑。乳酸菌在发酵过程中会产生多种酶，对所发酵的食材等底物起到降解、转化作用，或通过乳酸本身的代谢产生多种新的物质，所以，通过发酵赋予了传统水果新的口感和营养价值或新的功能。本研究利用稀释涂布法，筛选获得并鉴定了LactobacillusplantrumasZ。利用该菌株发酵了苹果汁初步探索了发酵工艺条件，对开发以苹果为原料的营养饮料做了有益尝试。

从本研究结果来看，虽然苹果汁的发酵产物营养成分有很大改善，但在功能方面还需要突出，比如通过发酵，在提高免疫力方面的功能还需要突出，这可能需要从改良发酵配方角度如添加几丁质水解产物（N-乙酰基葡萄糖等）进一步深入研究。

参考文献：

[1]袁越锦，焦丹，董继先，等.苹果切片干燥品质试验研究[J].陕西科技大学学报（自然科学版），2017，35（1）：139-144，150.

[2]李明澤，张霁红，宋娟，等.苹果醋发展现状及研究进展[J].甘肃农业科技，2018（7）：83-87.

[3]BouderbalaH，KaddouriH，KherouaO，etal.Anti-obesogeniceffectofapplecidervinegarinratssubjectedtoahighfatdiet][J].AnnalesdeCardiologieetdAngeiologie，2016，65（3）：208-213.

[4]WidyastutiY，FebrisiantosaA.Theroleoflacticacidbacteriainmilkfermentation[J].FoodandNutritionSciences，2014，5（4）：435-442.

[5]LiuSN，YeH，ZhouZJ.LacticacidbacteriaintraditionalfermentedChinesefoods[J].FoodResearchInternational，2011，44（3）：643-651.

[6]布坎南RE，吉本斯NE，等.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京：科学出版社，1984.

[7]何轶群，雷赵民，吴润，等.青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究[J].生物技术通报，2013（5）：177-183.

[8]武俊瑞，李欣，张苗，等.自然发酵酸菜汁中乳杆菌的分离鉴定[J].食品科学，2012，33（15）：191-194.

[9]潘晓倩，赵燕，张顺亮，等.中温乳化香肠中一株优势腐败菌的分离鉴定与生物学特性[J].食品科学，2016，37（7）：93-98.

[10]刘恒霞，余鹏，王慧忠.高效液相色谱测定蕨类植物中氨基酸含量[J].氨基酸和生物资源，2011，33（3）：30-33.

[11]李占清，魏海英.分光光度法测定新鲜蔬菜中维生素C的含量[J].中国无机分析化学，2014，4（3）：79-81.

[12]DiCagnoR，SuricoRF，ParadisoA，etal.Effectofautochthonouslacticacidbacteriastartersonhealth-promotingandsensorypropertiesoftomatojuices[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology，2009，128（3）：473-483.