颗粒细胞线粒体功能与卵母细胞发育相关性的研究进展

李贝贝，杜馨，张敏，姜宏

颗粒细胞的线粒体参与众多细胞内物质代谢，可利用葡萄糖的代谢产物丙酮酸为卵母细胞腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合成提供底物[1]，并保护卵母细胞免受氧化应激损伤[2]，正常的线粒体功能及颗粒细胞-卵母细胞间的相互作用是卵母细胞正常发育的必要条件[3]。本文对近年有关颗粒细胞线粒体功能与卵母细胞发育相关性的研究进展进行综述。

1 卵巢颗粒细胞与卵母细胞

卵泡是卵巢的基本功能单位，窦卵泡期卵巢颗粒细胞开始分化，根据其位置和功能分为两类，即位于壁层的颗粒细胞和围绕卵母细胞的卵丘颗粒细胞。前者是卵泡中具有分泌功能的主要细胞；后者与卵子在结构上紧密连接，形成卵丘细胞-卵母细胞复合体。在卵泡发生过程中，颗粒细胞与卵母细胞共享生长、成熟、衰老及退化信号，卵丘颗粒细胞可通过向卵母细胞输入卵母细胞转录信号、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、钙离子及其他代谢物，促使卵母细胞从静止状态激活，支持卵母细胞核和细胞质的成熟，而卵母细胞可分泌促进卵丘颗粒细胞分化和增殖的生长因子，维持和增强颗粒细胞功能。

卵母细胞与颗粒细胞主要通过缝隙连接蛋白43和连接蛋白45进行双向信息交流及新陈代谢物质传递[4]，缝隙连接的变化可改变卵母细胞成熟状态[5]。此外，卵母细胞与卵丘颗粒细胞间部分信号传递由配体和受体介导。动物实验证实，小鼠壁层颗粒细胞表达C型钠肽配体，卵丘颗粒细胞则存在C型钠肽受体，两者结合可控制卵母细胞减数分裂[6]。研究显示，与成熟卵母细胞的卵丘颗粒细胞共培养后可提高卵母细胞成熟率，表明卵丘颗粒细胞在卵母细胞最终成熟和排卵过程中发挥不可或缺的作用[7]。

cAMP由腺苷酸环化酶分解ATP产生，是哺乳动物卵母细胞成熟的关键调节因子，调控卵母细胞减数分裂的停止和恢复，在卵母细胞和卵丘颗粒细胞发育过程中起重要作用。排卵前，卵丘颗粒细胞产生的cAMP可通过缝隙连接运送到卵母细胞内，对卵母细胞核成熟有抑制和促进双重作用，持续升高的cAMP对卵子成熟起抑制作用，而短暂升高的cAMP则可促进卵母细胞核成熟[8]。哺乳动物中，卵母细胞cAMP水平的上升可抑制或延迟减数分裂的恢复，但这一现象在无卵丘颗粒细胞的裸卵中则不会发生[9]。

此外，卵母细胞还可通过旁分泌调节周围颗粒细胞的增殖、分化、凋亡及黄素化，表明在卵母细胞发育成熟过程中，颗粒细胞与卵母细胞相互影响，缺一不可[10]，卵丘细胞-卵母细胞复合体间的多条信号通路是卵母细胞发育的关键因素。

2 线粒体DNA（mtDNA）拷贝数

线粒体是一类属于母系遗传的细胞器，为众多细胞活动提供能量，并参与活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的管理和细胞凋亡的调控，是影响女性生殖过程的重要因素[11]。

MtDNA拷贝数是指线粒体基因组的数量，具有细胞间特异性，与线粒体功能密切相关，是衡量线粒体功能的重要指标。MtDNA通过编码呼吸链的多种组成成分参与细胞氧化磷酸化及ATP的合成过程，调控细胞的代谢和功能。颗粒细胞通过表达与mtDNA复制有关的信息因子，对卵母细胞发育过程中维持足够的mtDNA起重要作用。研究表明，颗粒细胞的mtDNA拷贝数与相应卵母细胞的mtDNA拷贝数呈正相关[12]，卵巢储备功能下降患者颗粒细胞凋亡率增高[13]，颗粒细胞中mtDNA拷贝数显著低于卵巢储备功能正常患者[12]。此外，卵丘颗粒细胞中mtDNA拷贝数与胚胎质量密切相关，优质胚胎的卵丘颗粒细胞mtDNA拷贝数显著高于质量较差胚胎的卵丘颗粒细胞[14]，卵丘颗粒细胞mtDNA拷贝数可以较好地预测体外受精过程中的胚胎质量，阳性预测值为84.4%，阴性预测值为82.1%[15]。

3 MtDNA突变及缺失

MtDNA 4 977 bp片段缺失是最为常见的mtDNA变异类型，可导致大量线粒体基因缺失，包括ATP酶6和ATP酶8基因、细胞色素氧化酶和泛醌还原酶相关基因等[16]，mtDNA 4 977 bp片段基因缺失的积累效应可导致线粒体功能障碍、ATP合成受损和细胞凋亡。

关于颗粒细胞中mtDNA是否存在4 977 bp片段缺失的报道不一。有学者认为卵巢储备功能正常及卵巢储备功能下降患者均不存在颗粒细胞mtDNA 4 977 bp片段缺失[17]，且年龄的升高并不增加卵丘颗粒细胞mtDNA 4 977 bp片段缺失率[18]。也有学者认为颗粒细胞存在mtDNA 4 977 bp片段缺失，且女性年龄与mtDNA突变率存在一定的关联，38岁以下妇女颗粒细胞mtDNA 4 977 bp片段的缺失率为41.7%，而≥38岁妇女缺失率高达100%[19]。

4 线粒体相关基因

线粒体相关基因与其产物在卵母细胞的形成和发育中扮演重要角色。卵母细胞与其周围的颗粒细胞间存在复杂且功能强大的基因通路，可调控卵母细胞及胚胎的发育潜能，卵丘颗粒细胞线粒体相关基因表达水平可作为评估卵母细胞质量的潜在生物标志物[20]。

PPARGC1A是调节线粒体生物合成的重要基因，有研究发现卵巢储备功能下降患者卵丘颗粒细胞的PPARGC1A基因表达水平显著下调[12]。在卵泡发育的后期阶段，颗粒细胞中与糖酵解有关的基因（如磷酸果糖激酶、M2型丙酮酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶等）表达水平均显著上调[21]。

线粒体基因的转录和翻译依赖核基因编码的各种蛋白因子的调控，在哺乳动物中已经鉴定出的两种转录因子有：线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM） 与线粒体转录因子B（mitochondrial transcription factor B，TFBM）。在哺乳动物线粒体生成中起到主要调节作用的是TFAM。TFAM是由TFAM基因在胞质内形成的246个氨基酸组成的小分子多肽，在线粒体靶向序列的转运下进入线粒体形成TFAM蛋白，TFAM以二聚体形式特异性结合到线粒体基因组的两个主要启动子——重链启动子（HSP）和轻链启动子（LSP）上游的特定位点，并通过募集线粒体RNA聚合酶和TFBM共同组成转录起始复合物，在线粒体中作为mtDNA转录的激活剂，激活线粒体的生物合成，调节mtDNA的转录、复制，维持mtDNA稳定性。因而，TFAM被认为是一种具有多效性功能的核基因编码的DNA结合蛋白，是生殖细胞mtDNA拷贝数的决定因子，可影响卵母细胞中mtDNA拷贝数，同时也参与线粒体氧化磷酸化产生ATP的过程[22]。

哺乳动物TFAM基因大小不一，长10～25 kb，一般含有6个内含子、7个外显子。TFAM基因启动子上存在多个转录因子结合位点，转录因子通过与TFAM基因的结合位点结合而调控该基因的表达。因TFAM与mtDNA拷贝数相关，被认为其可能是治疗线粒体相关疾病的一个有效靶点，目前已有大量关于TFAM与线粒体相关疾病的研究。研究发现，TFAM有利于卵母细胞发育、胚胎生长发育及提高受精率、优质胚胎率，推测TFAM可能通过影响卵母细胞的成熟，尤其是胞质成熟，继而影响体外受精-胚胎移植的妊娠结局，且TFAM的表达存在阈值，颗粒细胞TFAM mRNA水平过低或者过高均会对卵母细胞质量产生影响[23]。推测TFAM可以作为卵母细胞发育能力的预测因子，可能将为临床和实验室的辅助生育工作作出贡献。但颗粒细胞中TFAM的相关研究还不多，还需要更多研究证实。

5 线粒体跨膜电位

线粒体膜上存在通透性转换孔，其是由多个蛋白质组成的复合孔道，当其高水平开放时可导致线粒体膜电位降低，进一步导致线粒体肿胀，ATP水解，离子稳态被打破，细胞ATP水平下降，细胞质内钙离子水平上升，细胞凋亡。研究发现，未成熟的卵母细胞周围卵丘颗粒细胞线粒体膜电位显著低于成熟卵母细胞。此外，卵丘颗粒细胞线粒体膜电位的降低，可影响卵母细胞核与细胞质成熟的同步性[24]。体外受精过程中卵丘颗粒细胞线粒体膜电位与总获卵数、成熟卵母细胞数和正常受精卵母细胞数、6～8细胞胚胎数及囊胚数呈正相关[25]。

6 ATP水平

ATP是细胞能量供给的直接形式。卵母细胞主要依赖氧化磷酸化获取能量，颗粒细胞则主要依靠糖酵解获得能量，并通过缝隙连接将葡萄糖代谢产物输送至卵母细胞，维持卵母细胞的能量供给。颗粒细胞ATP水平与卵母细胞的发育和质量密切相关，包绕颗粒细胞的卵母细胞在成熟过程中ATP水平明显高于裸卵[26]。卵丘颗粒细胞中高度极化的线粒体是成熟哺乳动物卵母细胞的重要ATP来源，卵丘颗粒细胞ATP水平与获卵数、成熟卵母细胞比例、着床率及妊娠结局密切相关[27]。

7 ROS水平

ROS是一类来源于细胞代谢的高活性氧自由基，是氧化应激反应的重要标志物，是线粒体的产物，亦被当作线粒体功能指标的一种。在生殖细胞发育和成熟过程中，对能量和营养物质的需求不可避免地加快了新陈代谢速率，导致ROS积累。生理水平的ROS对卵母细胞成熟、排卵和早期胚胎发育至关重要。ROS过量则可诱发氧化应激反应，导致线粒体损伤，ATP含量降低，影响卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的形成和基因组的稳定，并导致颗粒细胞凋亡率增加，而颗粒细胞凋亡与体外受精-胚胎移植过程中低获卵率、低受精率、低卵裂率、低妊娠率及空卵泡综合征的发生密切相关[7]。卵泡液的ROS主要来自卵子及其周围的颗粒细胞，卵母细胞膜因为富含多聚不饱和脂肪酸更容易受到ROS攻击，及时有效清除ROS及其产物对于防止ROS进入卵母细胞、保证卵母细胞正常减数分裂非常重要。研究发现，卵泡液中高ROS水平与获卵数、卵母细胞和胚胎质量呈负相关[28]。

8 线粒体功能的改善

目前生殖细胞线粒体功能的改善方法包括线粒体移植、极体移植、使用线粒体营养剂等。2004年已有学者将颗粒细胞线粒体移植到体外受精-胚胎移植反复妊娠失败和高龄患者的卵子中，提高了患者的囊胚形成率，且获得了38.89%的临床妊娠率，证实利用自体颗粒细胞线粒体改善卵子质量的可行性，但研究的样本量较小[29]。在人或动物卵母细胞中进行颗粒细胞线粒体移植，结果均证明颗粒细胞线粒体移植对改善卵母细胞发育潜能具有非常重要的作用。

综上所述，在卵子成熟过程中，颗粒细胞线粒体作为细胞质内最重要的细胞器，其氧化磷酸化产生ATP的能力、mtDNA拷贝数、mtDNA突变或缺失水平、ROS水平、线粒体膜电位、线粒体相关基因表达水平等对卵母细胞发育成熟有着重要的影响，与卵子发育潜能及妊娠结局密切相关，可作为评估卵母细胞质量及改善卵母细胞发育潜能的替代细胞。对卵子成熟过程中颗粒细胞线粒体功能状况的研究有助于揭示卵母细胞发育的机制，从而进一步了解卵母细胞发育相关的生殖生理，为改善卵母细胞发育潜能提供新的思路。