血管内皮细胞在视网膜出芽式血管生成中的作用及其调控机制

姚牧笛，孙婷婷，蒋 沁

0引言

血管生成(angiogenesis)主要包括两种方式，即出芽式血管生成(sprouting angiogenesis)和分裂式血管生成(splitting angiogenesis)[1]。出芽式血管生成过程主要包括毛细血管基底膜的酶降解，减弱内皮细胞(endothelial cells，ECs)间连接，ECs向着血管生成刺激因子引导方向增殖、出芽，并发出细长的丝状伪足(filopodia)[2]。丝状伪足分泌蛋白水解酶，切割细胞外基质，为血管出芽开辟道路。随后血管融合，血管修剪，周细胞稳定[3]。分裂式血管生成是指现有的血管仅通过细胞重组分裂成为两个血管，其不依赖于细胞增殖或迁移。相较于出芽式血管生成，分裂式血管生成是一种快速的血管生成方式，通常发生在血管生成的早期[4]。血管生成在胚胎发育和心血管成熟过程中发挥重要作用，其正常发生高度依赖于血管内皮结构和功能的完整性。

1 ECs的生理特性和功能

血管内皮从中胚层发育而来，其是一个动态的器官，主要含有三种ECs，即Tip细胞、Stalk细胞、Phalanx细胞[5]。不同的ECs群具有不同的结构和功能，共同参与出芽式血管生成，调节血管形态和功能[6]。

Tip细胞和Stalk细胞位于血管出芽尖端，富含多种血管生成因子受体，可在血管生成信号的刺激下，向无血管区域出芽形成新生血管[7]。Tip细胞的主要功能是引导(guide)血管生长方向[8]，其含有丰富的丝状伪足，突出于细胞表面，在感知、迁移、细胞间交互作用中具有重要作用[9]。在血管生长过程中，丝状伪足探测组织环境，引导新生血管沿血管生成因子浓度梯度生长，并对给定的信号做出血管生长、停滞、转向或回退的反应[10]。Tip细胞与临近的血管出芽相联结，交织形成血管网。Tip细胞还含有其他多种细胞表面受体和分子，参与细胞外基质降解和基底膜沉积[11]。在出芽的部位紧随Tip细胞之后的是Stalk细胞，不同于Tip细胞的迁移能力，Stalk细胞的主要功能是细胞增殖[12]，以保证出芽血管不断延长并形成管腔。此外，Stalk细胞通过形成附着和紧密连接保证新生血管的稳定性和完整性[13]。Stalk细胞和Tip细胞存在相反的调控机制，在必要时可互换表型[14]。

除外Tip细胞和Stalk细胞，还有一种ECs是处于静止期的Phalanx细胞。单层静止的Phalanx细胞是构成血管内皮的重要部分，在血管腔和周围组织之间形成血管屏障，起到选择性滤过作用[15]。在病理条件下，内皮屏障功能破坏，血管通透性增加，可引起组织水肿、血液渗漏，新生血管形成。Phalanx细胞还参与凝血(血栓形成和纤溶)过程，同时在炎症、血管收缩与舒张等生理病理过程中发挥作用[15]。静止的Phalanx细胞多停滞在G0/G1阶段，处于非分裂状态，但保持增殖能力，必要时会向增殖期转化[16]。

ECs在生理和病理性血管生成中发挥着重要作用，正常的ECs细胞结构和功能是血管正常发育的重要基础，而其异常状态则参与了一系列病理过程，包括动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤、新生血管性眼病等[17]。在出芽式血管生成过程中，Tip细胞和Stalk细胞发挥了主要作用，以下我们对这两种细胞的调控机制做一概述。

2 ECs的调控机制

2.1信号通路参与血管生成过程的细胞因子有很多，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)[18]、Notch及其配体(Jagged1；Delta-like ligand，Dll)[19]、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor2，FGF2)[20]、血管生成素(angiopoietins，Ang1和Ang2)[21]、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)[22]等，其中VEGF/VEGFR和Notch/Notch配体参与了侵袭性血管出芽的早期过程。

2.1.1 VEGF/VEGFR信号通路在小鼠视网膜中，Tip细胞的丝状伪足表达丰富的VEGFR-2，相对缺氧的星形胶质细胞产生VEGFA，与VEGFR结合，引导Tip细胞沿VEGFA的浓度梯度方向生长。同时，高浓度VEGFA激活其同源受体VEGFR-2可引发细胞内的信号级联反应，诱导静止ECs分化为Tip细胞[23]。与Tip细胞相比，Stalk细胞的VEGFR-2表达水平相对较低，增殖形成新生血管主干[24]。新生血管尖端相互吻合，形成环状的血管网络。近年来有研究表明，VEGFR-3在Tip细胞中高表达，在小鼠发育期阻断VEGFR-3表达可使视网膜血管生成减少，刺激VEGFR-3同时抑制VEGFR-2仍可增加VEGFA诱导的血管生成，刺激血管生长，说明VEGFR-3可能也是血管生成的重要受体[25]。另有研究表明，Stalk细胞高表达VEGFR-1，抑制VEGFR-2，从而抑制临近细胞的Tip细胞表型。如今市场抗新生血管生成药物多针对VEGFR-2，根据基础研究的结果，VEGFR-3在血管生成中可能也发挥至关重要的作用，结合VEGFR-3在淋巴生成中的重要作用，也许未来可以解释抗VEGF治疗不敏感的现象。

在早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、湿性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)等视网膜新生血管性眼病中，VEGF表达异常是视网膜簇状病理性新生血管生成和渗漏形成的主要原因，因此引发的视网膜下积液、水肿和视网膜脱离会对视力产生不可逆性损伤[26]。因此，针对VEGF/VEGFR以及与其他信号间的关系，还需大量基础与临床实验进行探索挖掘，以期找到更精准的治疗靶点，针对不同病例提供个体化治疗方案，实现精准医疗的目标。

2.1.2 Notch/Delta信号通路越来越多的证据表明Notch信号在血管系统的发育和稳态中的重要性。Notch信号通路包括4种不同的跨膜受体(Notch1～4)和5种配体(Dll1/3/4和Jagged1/2)。Tip细胞高表达Dll4，通过Notch信号来抑制相邻Stalk细胞出现Tip细胞表型[27]。主要过程为低氧等刺激因素诱导VEGF信号通路活化，VEGFA激活Tip细胞的膜结合配体Dll4，Dll4信号传导至邻近ECs中，当Dll4与相邻细胞Notch受体Notch1相结合，γ-分泌酶即切割Notch1在该细胞质中的蛋白结构域使其转运至细胞核中，Notch1通过其下游效应子basic helix-loop-helix(bHLH)转录抑制因子HEY1(HESR1)与VEGFR-2启动子结合，直接抑制VEGFR-2的表达，同时可抑制VEGFR-3的表达[27]。暴露于高浓度VEGFA的ECs最有可能成为Tip细胞。在野生型小鼠视网膜中，使用Notch信号激活剂可抑制Tip细胞形成，减少血管密度；而抑制Notch信号，如使用Notch抑制剂可刺激Tip细胞增多，增加血管密度，但同时视网膜辐射状生长减慢[28]。另有研究发现，在野生型小鼠视网膜中，Tip细胞表达高水平Dll4[29]。在Dll4+/-视网膜中，尖端后段血管显示出严重的结构缺陷，形成多分支、高灌注的血管丛形态[29]。血管尖端和血管丛的丝状伪足均大量增多。Dll4+/-血管还表达较高的VEGFR-2、pdgfb和unc5b等，对VEGF信号具有更强的响应能力，导致具有Tip表型的ECs增多，因此视网膜血管表现出形态学变化(丝状伪足增多)和行为学变化(血管高灌注)[30]。这些证据表明Dll4+/-血管可能存在增殖缺陷，但其血管是有功能的，而血管的主要缺陷是由不适当且过度的血管出芽导致的。大量证据表明，Notch/Dll4和VEGF共同协调血管网的形成过程，说明Notch及其下游信号介导的ECs形态和功能的改变可能是治疗视网膜新生血管性疾病的重要方向。

2.1.3其他信号通路FGF2和VEGFA在体内和体外都是强有力的血管生成诱导因子，共同参与调控生理性和病理性血管生成过程。FGF2通过自分泌和旁分泌的形式诱导ECs中VEGFA的表达[31]。Ang1和Ang2是血管生成的关键调控因子，病理刺激作用下的ECs可产生大量Ang1/2，Ang1/2与内皮特异性受体酪氨酸激酶2(endothelial-specific receptor tyrosine kinase 2，TIE2)结合，通过Tie2-整合素(integrin)轴调控ECs对外源性细胞因子的反应性，调控Tip细胞迁移影响血管出芽过程[32]。另有研究表明，Ang2可能是海马相关蛋白(hippo-yes-associated protein，YAP)的潜在转录靶点，YAP可增加Ang2表达，调节ECs的功能；HGF在血管生成时与其同源受体肝细胞生长因子受体(mesenchymal-epithelial transition factor，Met)相互作用，通过增强VEGF的表达促进血管生成，而VEGF是血管生成的主要介质之一[33]。HGF-Met信号通路可触发一系列下游信号转导通路，包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI3k)和Akt，参与细胞迁移[34]；哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinases 1，MST1)受氧化应激等刺激后活化，磷酸化其底物叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1，FOXO1)，形成MST1-FOXO1信号通路。FOXO1在血管生成过程中可减少ECs糖酵解、线粒体呼吸，MST1作为FOXO1的上游调节子，通过建立Tip细胞极性来调节出芽式血管生成[35]。

2.2 ECs代谢近年研究表明，ECs代谢参与了血管出芽过程，这对生长因子的调控决定血管生成的传统理念提出了挑战。

2.2.1糖酵解在出芽式新生血管发生时，Tip细胞迁移至无血管的相对低氧微环境中，需利用无氧代谢产生能量。因此糖酵解活性高是Tip细胞的代谢特征之一[36]。在ROP和脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)发生过程中，糖酵解对视网膜血管丛的形成具有重要作用。当病理性新生血管生成时，VEGF浓度增高，糖酵解调节剂6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-双磷酸酶3(PFKFB3)会相应增高，增加Tip细胞活性，并促进Stalk细胞转化为Tip细胞；反之当PFKFB3基因表达下降或被药物阻断，Tip细胞在血管尖端的竞争力随之减弱，血管生长减慢[37]。因此，通过阻断PFKFB3联合抗VEGF治疗可能是促使血管出芽正常化的有效手段[37]。

糖酵解酶己糖激酶2(HK2)在血管生成和淋巴生成中也起到了关键作用。胚胎发育过程中敲除HK2会引起血管生成减慢，减少Tip细胞和血管分叉点(branch points)的数量[38]。在DR中，糖代谢异常引起早期视网膜血管细胞死亡和无细胞毛细血管生成。高血糖状态下ECs氧化应激反应升高，糖酵解酶磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)失活，导致糖酵解中间产物积累[39]。过量的葡萄糖随后被分流到多元醇途径，消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)并增加氧化应激反应[39]。总的来说，这些发现证实了ECs代谢在各种新生血管性眼病中的意义。

2.2.2胆固醇代谢除外糖酵解，胆固醇的周转和外排对于维持正常的细胞功能也是必不可少的。胆固醇过量会导致细胞异常增殖、迁移、炎症反应和死亡[40]。载脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-Ⅰ，apoA-Ⅰ)结合蛋白(apoA-Ⅰ binding protein，AIBP)加速胆固醇从ECs流出到高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)，从而调控血管生成[41]。AIBP和HDL介导的胆固醇损耗减少了细胞膜脂筏形成，而脂筏是VEGFR-2二聚和内吞所必需的结构，因此胆固醇的过度损耗可抑制VEGF诱导的血管生成[41]。在斑马鱼胚胎中，Tip细胞的脂筏含量比Stalk细胞高，提示在出芽尖端的VEGFR2信号通路存在胆固醇依赖的正向调控，干扰胆固醇外排可导致血管生成失调[42]。据此可推测，胆固醇代谢可通过影响VEGF/VEGFR信号调控视网膜新生血管性眼病的进展。

2.2.3谷氨酰胺代谢ECs可表达谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)，GS不仅可从头合成谷氨酰胺，还可以清除体内多余的氨[43]。内皮GS缺陷可引起ECs迁移失调，减少出芽式血管生成，从而减少眼部病理性血管生成。这种作用可能是通过GS调节RHOJ信号来实现的，但这两者之间的具体作用机制尚不清楚[44]。此外，内皮GS缺陷不会引起ECs增殖障碍，说明GS功能缺陷与否与Stalk细胞关系并不大[44]。总之由于GS在血管生成中的重要作用，谷氨酰胺代谢在视网膜新生血管性眼病中也发挥了一定作用，其具体机制仍需进一步探究。

2.3免疫炎症自身反应性CD4+T细胞浸润损伤的炎症组织，可促进周围血管的愈合。其中CD4+T细胞亚群Th1和Th17分泌的细胞因子能够直接促进ECs出芽，在缺血性损伤中促进血管生成和血液灌注[45]。说明CD4+T细胞可能是参与调控新生血管性眼病中ECs功能的重要细胞群。此外，近年研究表明白介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)在血管生成过程中参与ECs和巨噬细胞的窜扰(crosstalk)。在ROP动物模型实验中发现，IL-17A水平随病情进展而升高，其通过调节VEGF信号通路调节新生血管生成，抑制IL-17A表达可显著减少新生血管生成。同时，IL-17A基因缺陷可促使巨噬细胞向M2表型转变。IL-17A可通过调节巨噬细胞极性和调节VEGF表达来调控ECs增殖、迁移和出芽，从而调控炎症反应和组织修复过程，说明IL-17A可能是治疗眼部新生血管性疾病的潜在靶点[46]。

2.4非编码RNA非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是转录组中不翻译为蛋白质的RNA分子，包括微小RNA(microRNA，miRNA)等相对分子量较小的RNA和长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等相对分子量较大的RNA。研究表明，许多ncRNA在血管生成过程中发挥作用。ECs中miRNA-302-367的升高可通过Erk1/2-Klf2-S1pr1通路减少视网膜新生血管的生成，并促进血管的稳定性[47]；miRNA-223的过表达可减少VEGF和FGF诱导的细胞增殖、迁移和出芽，其可能是通过靶向β1整合素(β1 integrin)发挥抗血管生成的作用[48]；lncRNA-MALAT1的沉默可增加Tip细胞迁移和出芽，但抑制Stalk细胞增殖，因此可减少视网膜病理性新生血管生成[49]。许多研究表明，ncRNA通过调控不同信号转导和蛋白表达参与视网膜新生血管性眼病的发生发展，在表观遗传学的调控中扮演了越来越重要的角色，但是其潜能仍需大量基础和临床研究进行验证，以期为人们从基因表达调控网络的维度来认识生命体的复杂性开启新的天地。

3总结与展望

ECs尤其是血管尖端的Tip细胞和Stalk细胞在视网膜出芽式血管生成中发挥了重要功能，参与了视网膜生理性血管发育和病理性新生血管形成的重要过程。其调控机制有很多，多种信号通路、ECs代谢、免疫炎症、ncRNA等均参与了ECs的调控作用，但绝大多数调控机制均是通过VEGF/VEGFR通路发挥作用的。因此针对VEGF/VEGFR的治疗仍是临床中抗新生血管生成的重要方法，但是针对其他上游机制的研究可能为靶向性治疗提供新思路。