动静态小鼠胚胎培养方法的囊胚获得率的对比▲

李 楠 张名媛 阳晓敏 林 忠

(1 广西柳州市妇幼保健院生殖医学中心/柳州市生殖与遗传研究所/广西科技大学附属妇产医院、儿童医院，柳州市 545001,电子邮箱：linan520672@126.com；2 广西医科大学实验动物中心，南宁市 530021；3 广西壮族自治区生殖医院妇产科，南宁市 530021)

人类辅助生育技术(assisted reproductive technology，ART)已成为治疗各种原因导致不孕不育的主要手段，但是ART的临床妊娠率仅约为30%，仍有很大的提高空间。移植高质量的胚胎是提高临床妊娠率的关键，因此如何提高早期体外培养胚胎(第3天、第5天或第6天囊胚)的质量成为ART的重点研究课题之一。

目前，有关ART的研究都集中在优化培养液体上，如改进培养液的成分、补充能量、增加生长因子等。如何利用现在的培养液、气体等条件，更加准确地模拟输卵管内早期胚胎生长发育的环境，给胚胎一个更加接近或者相似的母体内培养环境，从而提高早期胚胎质量，是我们所面临的主要问题。虽然相关技术不断成熟，培养液(序贯培养液和阶段培养液)、培养箱(单气和三气)等方面的优化仍未得到很好的改进，导致ART的妊娠率未能提高。在静态微滴培养下，随着胚胎代谢活动的逐渐增强，各类代谢产物、胚胎毒性物质不断积累，而营养物质不断被消耗，导致胚胎的发育能力受到阻碍[1]。有学者对早期胚胎在输卵管内的发育过程及输卵管内的生理表现进行研究，发现输卵管内的纤毛细胞通过摆动引导胚胎向子宫移动，在这个过程中纤毛细胞还会产生6～20 Hz持续性的脉冲力，他们认为胚胎在体内的发育环境是动态的，是向子宫腔内移动的，其中早期胚胎周围的化学环境和物理环境在不断地发生变化[2]。本研究利用Viboviduct 1500胚胎微脉冲震动仪，模拟输卵管内的动态环境，促进胚胎与培养液中物质的交换，观察胚胎的体外发育情况，为提高早期体外培养胚胎的质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 20只昆明雌鼠，8～10周龄，体重40～45 g，10只昆明雄鼠，10～12周龄，体重50～55 g，动物及饲料、垫料均购自广西医科大学的实验动物中心(动物许可证号SCXK桂2014-0002)。昆明鼠在12/12 h昼夜交替，湿度为45%～70%的25℃饲养环境中喂养，自主饮水和摄食，适应性饲养1周后按照程序进行超排卵。

1.2 主要药品与试剂 人绝经期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG；批号：180908)、绒促性素(批号：180902)均购自丽珠药业公司，均在有效期内使用。精子梯度分离液(批号：上层为99257190704，下层为99258190705)、人输卵管液(human tubal fluid,HTF；批号：90126180603)操作液、血清蛋白替代品(批号：99193180302)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS；批号：9235171121)、胚胎培养矿物油(批号：507333)均购自美国Irvine公司。洗精液(批号：507573)、受精液(批号：507573)、卵裂培养液(G1，批号：507674)和囊胚培养液(G2，批号：507675)购自瑞典Vitrolife公司。

1.3 方法

1.3.1 超排卵干预：适应性喂养1周后，实验第1天5：00 PM给雌性小鼠腹腔注射0.1 mL(10 U)HMG，48 h后，注射0.1 mL(10 U)绒促性素。

1.3.2 体外受精及胚胎培养：(1)卵母细胞的获取。注射绒促性素14 h后，脱颈处死雌鼠，剖取输卵管，用PBS洗涤后置于平皿内。无菌环境下，于解剖显微镜下用解剖针轻轻刺破输卵管的膨大部，使卵母细胞自然流出，使用巴斯德管分离卵母细胞，将卵母细胞放入60 mm的4孔培养皿中。(2)精液的获取。参照文献[3]获取精液，脱颈处死雄鼠，截取附睾尾，用PBS洗涤后置于平皿内。在无菌环境下，于解剖显微镜下用解剖针刺破附睾，释放出精子，将精子挑到200 μL平衡过夜的受精液滴中，置于相应的培养箱(6.0%二氧化碳、37℃、100%湿度)中培养约1 h，精子获能。(3)胚胎培养：将5～10 μL获能的精子加入含有卵母细胞的60 mm 4孔培养皿中，置于培养箱(6.0%二氧化碳、37℃、100%湿度)中培养6 h后洗卵，将受精卵挑出放入含有卵裂液的培养皿中、置于培养箱(6.0%二氧化碳、37℃、100%湿度)再培养24 h，收集受精胚胎。将获得的胚胎随机分为静态培养组和动态胚胎培养组。静态培养组将胚胎分别放置于含卵裂培养液和囊胚培养液微滴的胚胎培养皿中，静置于6%二氧化碳，100%湿度、37℃的培养箱培养114 h。动态胚胎培养组则将胚胎培养皿放置于Viboviduct 1500胚胎微脉冲震动仪(德国SimSoTec公司)上，Viboviduct 1500的设置参数为42 Hz,6 s/60 min，其他操作与静态培养组相同，实验所用的液体均需要过夜平衡处理，胚胎培养及受精所用液体均在6.0%二氧化碳、37℃、100%湿度环境中过夜平衡处理。

1.4 观察指标 将获得的胚胎置于培养箱中，以完成绒促性素注射后计算时间，经72 h和114 h分别得到8细胞期的胚胎和囊胚，记录静态培养及动态培养的卵裂胚胎数和囊胚数。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

共110个胚胎行静态培养，卵裂胚胎数102个，囊胚数89个，囊胚率为80.9%；共120个胚胎行动态培养，卵裂胚胎数113个，囊胚数111个，囊胚率为92.5%。动态培养的囊胚率高于静态培养(χ2=6.798,P=0.009)。

3 讨 论

培养出高质量的胚胎，是行体外受精-胚胎移植后获得妊娠的主要因素之一。虽然体外胚胎培养技术已取得很大的进步，但目前所使用的静止微滴培养系统仍无法完全模拟哺乳动物雌性生殖道的生理及环境条件[4]。静态培养系统所获胚胎与体内生长发育的胚胎相比仍存在较多缺点，如有较高的染色体倍型异常率，RNA活性存在差异，大量辅助因子的基因出现异常表达，冷冻保存后解冻复苏效果较差等，导致移植后获得的胚胎存在较多问题。研究显示，体内的胚胎在发育过程中处于一个动态的环境：着床前的胚胎是独立的，在输卵管内自由浮动，借助液体的流动不断移动到达子宫并植入子宫[5]。但培养箱内的环境则是静态的。

为解决静态培养所面临的问题，有学者提出了动态培养，认为其可以更好地模拟女性输卵管内的生理环境和体内动态环境，促进胚胎发育和提高胚胎质量[6]。德国SimsoTec公司推出了Viboviduct 1500微脉冲震荡仪，该产品可模仿女性输卵管的振动[7]，通过设置振动的强度、频率和时间间隔，模拟输卵管对胚胎的刺激从而提高胚胎体外培养的质量[8]。其还可以避免流体剪切力对细胞的损害，消除代谢物蓄积对胚胎生长发育的不利影响，有效模拟输卵管的内部微环境，激活营养信号通路等，从而促进胚胎发育和提高胚胎质量[9]。Heo等[10]研究微流控的动态胚胎培养对小鼠胚胎发育的影响，发现动态胚胎培养的孵化囊胚数和内细胞团数均多于静置培养体系，且与体内来源的囊胚相似。这提示动态胚胎培养法不仅有利于小鼠植入前胚胎发育，而且提高了胚胎的种植率和继续妊娠率，有效降低了流产率。Hur 等[11]认为，动态培养可以显著提高优胚率及囊胚细胞数，以及D5的囊胚率和临床妊娠率。Isachenko等[12]的研究结果显示，脉冲振动可以显著提高胚胎的发育能力和临床妊娠率。此外有研究显示，使用动态培养可以促进钙离子的流通，不会影响胚胎的自分泌生长因子，可提高优胚率和囊胚率[13]。本研究结果显示，与静态培养相比，动态培养可以提高囊胚率。这提示基于Viboviduct 1500微脉冲震荡仪的胚胎动态培养方法，可通过设置微动力的频率和时间来调整培养液，同时模拟体内胚胎输卵管的机械和生化环境，从而提高胚胎的发育潜能。

综上所述，基于Viboviduct 1500微脉冲震荡仪的胚胎动态培养方法，可以提高胚胎的发育潜能，提高囊胚率。但本研究尚处于初级阶段，还需要大量的临床试验数据来证实其应用于人类胚胎培养的可行性。