粮食中真菌毒素快速检测技术的发展及应用验证评价

蓝熊静

(广西壮族自治区粮油质量检测中心，南宁530031)

0 引言

民以食为天，食以粮为本，作为人口大国，我国的粮食安全问题一直是关乎国计民生的头等大事。随着人民对粮食的要求从“吃饱”到“吃好吃健康”的变化，我国粮食生产也由数量导向转变为质量导向。真菌毒素污染是造成粮食质量安全问题的重要因素之一。据统计，全世界食品供应的25%受到真菌毒素的污染[1]，而我国是受真菌毒素污染最严重的国家之一。据国家粮食局统计，我国每年有3100万t粮食在生产、储存、运输过程中被真菌毒素污染，约占粮食年总产量的6.2%[2]。

适宜的环境条件容易滋生产毒真菌，真菌毒素是真菌在生长过程产生的次生代谢产物，主要包括黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、付马毒素等。其污染范围广泛，玉米、小麦、大麦、花生等谷物以及干果、水果、中药材、牛奶等都容易被真菌毒素污染，尤其易污染谷物类等粮食作物[3]。由于真菌毒素具有致畸、致癌、致突变等特性，易延伸至食物链，对人和动物健康带来严重危险[4]。

为了能够“把中国人的饭碗牢牢端在中国人自己手上”，适应我国粮食生产、储存、流通以及监管的要求，虽然已经有很多准确检测真菌毒素的实验室方法，但把风险控制在前端更为重要，因此在粮食检测中应用好真菌毒素的快检技术具有重要的意义[5]。本文系统介绍了关于粮食中真菌毒素的主要快速检测技术和装备，对其优缺点进行分析，并从实际应用和需求出发，结合粮食真菌毒素快速检测技术的验证评价工作经验，预测了该领域技术的发展方向，以期对我国粮食质量安全快检领域的良性发展提供参考。

1 各种真菌毒素快速检测技术优缺点及发展应用

真菌毒素现有检测方法比较多，包括生物鉴定法、化学分析法、仪器分析法和免疫分析法等。生物鉴定法专一性不强；化学分析法精确度低；仪器分析灵敏度高，可准确定量，但样本前处理复杂并且检测仪器昂贵，难以在基层实验室推广使用[6]；免疫分析法是最早研究的快速检测技术，也是目前市场上应用最多的快速检测方法。由于我国粮食现场收购特点，对真菌毒素的快速定量检测技术发展应用要求迫切，相关部门也在加快研究推进粮食中真菌毒素快速检测技术的发展，并制定相关行业标准，力争进一步提高检测技术，保证粮食质量安全。目前的真菌毒素快速检测方法主要有免疫分析法、无损检测法等新型检测方法，免疫分析法应用得比较多。

1.1 免疫分析法

真菌毒素是真菌产生的小分子有毒代谢产物，通过与蛋白质等大分子载体结合而成为人工抗原[7]。免疫分析法是利用抗原和抗体的特异性结合反应以及抗体或抗原(含半抗原)上标记物的信号放大作用，实现对微量残留物的定性定量检测。其灵敏度高、检测成本低、方便快速，是目前最具有代表性的真菌毒素等小分子污染物快速检测技术[8]。根据标记物的不同，免疫分析快速检测技术可分为胶体金免疫层析法、荧光免疫分析法、酶联免疫法、化学发光免疫法、免疫传感器法和免疫芯片检测法等。

1.1.1 胶体金免疫层析法

该法是通过将抗原或抗体包被于固相载体硝酸纤维素膜上，检测时，待检样本与标记探针经层析作用，与包被的抗原或抗体发生特异反应，聚集后显现信号条带，可通过肉眼对结果进行定性判定，同时也可借助信号采集仪器进行定量分析。制备稳定的胶体金标记物是胶体金产品的一个技术瓶颈，导致胶体金产品容易出现批间差较大的情况，这就对胶体金产品的生产工艺提出更高的要求。真菌毒素胶体金定量检测卡的主要代表厂家是美国的cham公司。cham的产品很早就占据了国内粮食真菌毒素的快速检测市场，目前依然占据很大的份额。

胶体金免疫层析快检技术，是目前粮食真菌毒素快检设备选择的主流技术，经过十几年的研究发展，基本实现准确、快速、简便、稳定的快速检测要求。真菌毒素的抗体包括高特异性抗体和广谱抗体，可以满足单种或多种的检测需求。在保证检测结果准确的前提下，人们尝试统一前处理方法和采用“环境友好”的前处理试剂，适配体、受体技术、纳米抗体等新技术在真菌毒素测中得到了应用[9]，以胶体金试纸条为基础的多重检测模式已成为快速检测领域的研究重点。

1.1.2 荧光免疫层析法

标记取代酶联免疫检测法中的酶标记，通过检测荧光信号对结果进行测定的荧光免疫技术属于发展较早的标记免疫技术，相对吸光度检测，具有更高的检测灵敏度，可满足对特殊靶物质微量或超微量的检测需求。常见的荧光免疫分析法包括荧光免疫分析(IFMA)、荧光偏振免疫分析(FPlA)、荧光激发共振能量转移免疫分析(FRETIA)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)和多组分免疫分析。

荧光免疫层析法的稳定性好，有效克服了胶体金免疫层析技术批间差大的弱点；其次，TRFIA灵敏度高，在前处理方面改进的空间更大。目前市场广泛推广的快速检测技术产品中，荧光免疫层析技术也是主流之一。

1.1.3 酶联免疫法

其基本原理是采用抗原或抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。酶联免疫吸附分析法作为真菌毒素最为常用的免疫学检测方法，具有高灵敏度和高特异性的特点，并且样本前处理简单，可对批量样本进行低成本、快速筛查。按反应机制可以将酶联免疫法分为以下几种：双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法、捕获法。酶联免疫检测法适合基层单位对样本的快速筛查，阳性结果后续可经仪器法确证，方便大规模推广使用。

1.1.4 化学发光免疫法

化学发光免疫法将免疫反应与化学发光相结合，通过化学发光检测仪对信号进行测定，化学发光具有荧光特性，无需激发光源，可避免信号在采集和分析时的干扰。根据标记物不同可分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析[10]。化学发光免疫分析通过鲁米诺或吖啶酯类等试剂直接标记抗体或抗原实现检测。

1.1.5 免疫传感器法

免疫传感器法将免疫学反应与传感器技术相结合，基于抗原抗体的反应为检测的特异性提供保证，同时传感器技术具有高灵敏度，从而实现对待检物质的精准检测。根据免疫传感器中换能器的不同，可分为电化学免疫传感器、质量检测免疫传感器、热量检测免疫传感器和光学免疫传感器。该方法在食品安全监测、环境中有毒有害物质和癌症标志物检测领域应用广泛，目前也已成为真菌毒素等小分子的有效检测手段。

1.1.6 免疫芯片检测法

芯片模式可对大量样本中多种分析物进行同时定性检测或定量分析。免疫芯片又称抗体芯片，是目前最重要和研究最多的一种新型蛋白芯片检测技术，基于抗原抗体间特异性反应，可分为固相和液相两种模式。免疫芯片检测法在临床疾病诊断、药物筛选、环境中有毒有害物质检测和食品安全监管领域均得到广泛应用，在真菌毒素检测方面，固相和液相芯片检测模式均有相关报道。

1.2 真菌毒素无损检测法

无损检测技术作为一门新兴的检测技术日益受到广泛关注。可以在不破坏农产品品质的基础上，利用样品的光学、电学、声学等特性，结合现代信息处理技术，对农产品品质进行准确、快速检测[14]。通过以上研究发现，以近红外光谱、高光谱图像以及电子鼻为代表的无损检测技术在粮食受真菌毒素污染的检测上也取得了积极进展，但总体还处于初步探索的阶段[11，12，13]。目前无损检测主要用于定性筛分，定量检测研究不够多，限制了其应用范围[14]。

2 粮食中真菌毒素快速检测技术的应用验证评价方法

近年来粮食产业链中，很多企业和库点都配备了相应的真菌快检设备，但是不少客户对真菌毒素快检设备的应用持观望态度，主要原因是对快检仪器的准确性上把握不好，缺乏指导性的验证方案，来确保检测结果准确性。为了加快推进真菌毒素快速检测技术的应用和推广，参照我国粮食行业标准中设备和方法标准适用性验证及结果评价一般原则[15]，结合2019年我国粮食局组织开展的真菌毒素快速检测验证会（对十几个国内外真菌毒素快速检测生产厂商的仪器、方法和耗材进行验证）工作经验，提出如下真菌毒素快速检测技术验证方案：

2.1 具体验证方案

真菌毒素主要污染的粮食及制品有稻谷、小麦、玉米、油脂，常检测的项目为AFB1、DON、ZEN。真菌毒素快速检测技术主要通过如下项目：检出限、定量限、准确性、台间差、重复性、稳定性和单样检测时间等来对其整体技术进行验证。

2.1.1 检出限和定量限

随机挑选一台设备，一般选择实验室检出率高的样品类型，采用对应真菌毒素各种类型的阴性样品、分别各自独立测定20次。

2.1.2 准确性和台间差测试

两台设备，每个真菌毒素选两种样品类型，分别进行6个浓度梯度的双试验测定（每台设备、每个水平2个数据）；两台设备测定值采用同一个样品提取液分别在两条测试卡上点样，各自读卡器中读数。

6个梯度浓度点，选择在定量限到3倍产品限量间。样品准备，通过计算后，采用不同梯度浓度，称量对应量阳性样品（有证的标准实物），补足阴性样品量到实验总称样量。

2.1.3 重复性测试

选取一台测试设备，对中等水平浓度（一般选择产品限量）的不同类型真菌毒素，分别独立测定6次。

2.1.4 稳定性测试

随机挑选一台仪器对常检测的一种真菌毒素的标准溶液（或自带的标准卡）进行连续12h测试，每小时测定一个数据，共13个数据。

2.1.5 检测时间的确定

从称样开始计时，到记录数据结束，记录下检测一个单样品的完整时间。

2.1.6 数据处理及结果评价样品的前处理，称量应严格按照标准要求进行，如实记录在检测过程中出现的问题等内容，对设备外观、操作方便性等方面亦应该进行评价。

2.1.6 .1检出限采用20个阴性样品检测值的均值，加上3倍标准偏差计算。

2.1.6 .2定量限采用20个阴性样品检测值的均值，加上10倍标准偏差计算。

2.1.6 .3准确性采用测定值与定值进行配对T检验，考察两方法的检测结果是否存在显著性差异。

2.1.6 .4重复性采用X2检验，将国家标准方法中规定的重复性要求转换成标准差，考察重复性标准差是否超过标准方法中给定的标准差。

2.1.6 .5稳定性采用X2检验，将国家标准方法中规定的重复性要求转换成标准差，考察稳定性标准差是否超过标准方法中给定的标准差。

2.1.6 .6台间差两台设备测定均值进行配对T检验，考察两台设备的测定结果是否存在显著性差异。

根据各项数据检测结果，按照评价规则和对应国家标准对每个项目的各项指标具体要求，参考操作的便捷性和时效性，最后对该真菌毒素快检设备进行全面结果评价。

在实际的粮食真菌毒素快速检测工作中，基层单位和企业可以按照自己的具体情况，选择用质控样品或留样复测以及比对等方式对整个检测过程进行质量控制；特别是对检测的临界值样品要用其他方法进行比对、确认，以防检测结果的假阳性和阴性[16]，并据使用频率自行确定验证周期。

3 结语

为了保障国家粮食质量安全，对粮食中真菌毒素的风险监控刻不容缓。近几年新型仪器分析法和以免疫为基础的分析法发展迅速，其以简单、快速、低毒、易操作的优势，弥补了现行国家标准方法的不足，更适合粮油等农产品收购现场快速检测的需要，是目前真菌毒素科研分析领域的主流，并陆续纳入行业标准范围之内。多种真菌毒素混合污染的情况时有发生，并且随着全社会关注度的提高，单一定性已不能满足未来的检测需求。未来真菌毒素检测技术既需要不断提高确证性实验分析水平，实现对痕量目标物的准确定量，也需要结合实践，发展方便、多元、快速、低毒、准确及低成本的快速检测技术。期待本文所述真菌毒素快速检测应用验证评价方法，能对粮食基层工作者在快速检测技术的实际应用中提供有益参考。