肺部微生态在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展

陈琳 周红

哈尔滨医科大学附属第一医院呼吸内科150001

COPD是一种以持续存在的呼吸系统症状和气流受限为特征的疾病。由于其患病人数多,病死率高,消耗大量社会资源,所以受到人们的广泛关注。目前对于COPD的相关研究甚多,但目前没有确切的治疗方法可以阻止COPD的进展,因此迫切需要对其发病机制进行新的探索。除了已知的机制之外[1],有学者提出细胞凋亡假说、自身免疫反应、微生物组的变化以及无效的受损修复机制等[2]。最新发布的慢性阻塞性肺疾病全球倡议2019新增了关于COPD危险因素的4项研究,包括社会经济地位、室内生物燃料、人类免疫缺陷病毒感染及基因多态性[3-8]。目前随着一些新的测序技术的发现,有关微生物组的变化的研究受到人们的高度重视,特别是肺部微生态。但肺部菌群在COPD患者中的地位和作用一直存在争议,但随着研究技术的发展,可能为研究COPD的发病机制和治疗方法提供一个新视角。因此,本文就目前国内外关于肺部微生态在COPD中的研究进展进行系统阐述。

1 COPD的肺部菌群与下呼吸道微生态的研究方法

1.1 COPD的肺部菌群 人体的呼吸道分上、下呼吸道,由于呼吸道与外界相通,所以无论是上呼吸道或是下呼吸道应该都存在一定的微生物,但是人们对下呼吸道及肺部的微生物菌群的研究却少之又少。传统观念认为由于上呼吸道的黏液及纤毛运动的作用,颗粒物和微生物到达不了下呼吸道,所以认为下呼吸道及肺部是无菌的。但是随着支气管镜及非培养的微生物检测技术的发展,目前证明健康人群的肺部并不是无菌的,并明确研究了几种肺部疾病中的微生物菌群组的变化[9-13]。相关研究表明肺部存在的部分菌群与口鼻咽部菌群重叠,但肺部缺少存在于口鼻咽部的棒状杆菌属、狡诈菌属等,研究还发现口鼻咽部同样也缺少肺部的部分菌群如惠普尔养障体等,这也提示了口鼻咽部可能并不是肺部微生物的唯一途径[14-15]。

COPD的肺部菌群相关研究结果表明,随着COPD病情进展,肺部菌群的多样性也会随之改变。Millares等[16]通过16S r RNA基因扩增和焦磷酸测序分析了同一COPD患者不同严重程度的痰液标本情况,发现链球菌、假单胞菌、莫拉菌、嗜血杆菌、奈瑟菌、无色杆菌和棒状杆菌属在急性加重期的相对丰度增加超过20%,但在2组之间没有发现生物多样性参数的显著差异。Erb-Downward等[17]对COPD患者与 “健康”吸烟者的支气管肺泡灌洗液进行测序,发现中度和重度患者中肺部微生物组的菌群多样性减低。同时此项研究的实验者通过获得的COPD患者的肺外植体进行解剖学分析发现,晚期COPD患者的同一肺部细菌群落中可能存在显著的微观解剖差异。而且这在受试者左肺上叶特别明显,嗜血杆菌在左肺上叶的节段性支气管中占主导地位,嗜麦芽窄食菌在左肺上叶的远端支气管中占主导地位,形成鲜明对比的是,假单胞菌在中上支气管和同一肺内的许多其他部位中占主导地位。

目前有研究者提出了COPD的肺部菌群 “恶性循环假说”,该假说提出有吸烟史的COPD患者,因吸烟带来的气道黏膜清除能力下降,当微生物进入呼吸道后可在肺部定植,随后进一步损伤肺部防御功能,损伤气道黏膜,并且可识别受体诱导炎症及免疫反应,而炎症反应又会损害宿主的免疫力,进而使得微生物长期的定植于肺部,最终导致肺部的慢性炎症和微生物定植,形成恶性循环[18-19]。

1.2 下呼吸道微生态的研究方法

1.2.1 下呼吸道的标本采集及评价 由于下呼吸道的解剖结构的特殊性和病原学的复杂性,准确的完成下呼吸道的标本采集并非易事。痰标本的质量可直接影响病原学诊断的准确性和可靠性。常见的标本采集方法及评价如下,(1)咳痰标本:此方法应用最早且最广泛,采集方便、易行,但由于会受到口咽部定植菌的污染,所以最受争议。(2)经支气管镜采样:包括经纤维支气管镜吸引、防污染毛刷采样、支气管肺泡灌洗等。这些方法可以减少标本的污染,提高微生物的检出率,这将有益于肺部微生态的研究进展。(3)经气管穿刺吸引物:一般认为经气管穿刺吸引物敏感性较高,但特异性欠佳,且创伤性较大,目前临床上已经被防污染套管毛刷等其他技术所取代。(4)经胸壁针刺吸引物:与其他有创操作相比,经胸壁针刺吸引物特异性较高而敏感性较差。(5)开胸肺活检组织标本:组织既可送检病理检查,还可做微生物学检验,准确率高,最大缺陷就是需要全身麻醉及实施胸廓切开术。(6)经人工气道吸引物:此方法收集的分泌物是目前临床较常用的微生物检验标本,但由于一些致病菌的存在,故建立人工气道患者肺部病原学诊断更为困难。

1.2.2 下呼吸道微生态的实验室检测方法 目前常见的检测方法包括:涂片镜检、培养鉴定、组织病理、免疫学和分子生物学技术检测等。其中前两种是人们早期常用的检测方法,但检测的肺部微生物有限。随着非培养检测技术的出现与发展,目前对于肺部微生态的研究得到了进一步的了解。常见的分子生物学技术检测方法主要包括基因测序技术、宏基因组技术、PCR技术、基因芯片技术、指纹图谱技术、FISH荧光原位杂交技术,末端限制性片段长度多态性分析技术等[20]。其中针对肺部微生态较为常用的方法是基因测序技术及宏基因组技术。基因测序方法包括16S r RNA全长基因测序法及焦磷酸测序法。16S r RNA全长基因测序技术[21]是通过对比已知数据库的基因序列与通过测序获得的16S r RNA全长基因序列,来确定标本中的微生物种类。新一代的DNA测序技术焦磷酸测序法[22]是基于酶级联反应的序列分析技术,它将退火后的引物与检测样本模板DNA在4种酶的作用下,耦联引物上每一个脱氧核糖核苷三磷酸的聚合与荧光信号的释放,最后通过仪器测定荧光信号的强度,达到实时检测DNA序列的每一个碱基,并得到一定的峰值。宏基因组技术[23]是从样本中直接提取全部微生物DNA或RNA,建立一个文库,然后研究及分析全部微生物的遗传组成及功能基因,它对于研究肺部微生态的多样性提供了一种新的方式。

2 COPD与肠道菌群微生态失衡的相关研究

对于COPD的病理机制的研究,目前仍认为慢性气道炎症是关键,但对于COPD的疾病本质仍无明确揭示,且COPD稳定期的治疗仍缺乏有效的方法,所以需要从新的角度来认识COPD的根本病因及发展机制。目前有相关研究证明COPD患者常常合并胃肠道疾病,例如炎症性肠病[24]或肠易激综合征[25]。Madan等[26]通过研究婴儿从出生到21个月期间呼吸道和肠道微生物群的动态变化情况显示,肠道菌群的定植预示着呼吸道菌群的种类,并且存在有很大的重叠性,同时随着时间的推移,细菌多样性显著增加,且呼吸道中菌群获得的多样性更快。此外,实验表明饮食的变化也会导致呼吸道微生物群落的改变,这表明营养与呼吸道微生物群落的发展之间存在联系。有研究表明人体正常菌群与宿主共生,在肠道中具有特定的优势。所以在正常情况下肠黏膜的共生菌可以阻止病原菌的入侵,这一现象被称为 “细菌拮抗”或 “细菌干扰”[27]。对于肺部微生物,有研究者对健康个体肺部微生物进行DNA检测,发现口腔和肺部的微生物群落的分类谱相似,所以这些微生物可能是通过口腔少量吸入进入肺部,并短期内繁殖。但实验发现特定细菌在肺中的丰度显著高于从口腔中出现的预期,表明肺微生物组不完全来自口腔[28]。并且肺部微生物的环境条件与其他部位不同。综上,微生物的短暂性进入以及其选择性消除是肺部微生物组成和稳态维持的主要决定因素。

在COPD的发生、发展中,有各种因素可导致肠道微生态的失衡,例如抗生素的使用、生活方式的不同、饮食习惯的改变等。当COPD处于急性加重期,大量使用广谱抗生素后,肠道的屏障作用下降,肠道内正常的寄生菌生长受到抑制,而栖居在胃肠道下端的革兰阴性杆菌及霉菌开始增殖,导致正常的菌群生态组成发生改变,引起菌群失调。大量的革兰阴性菌细胞壁溶解,释放大量的具有多种生物活性的内毒素[29],当肝脏无法完全解毒及相应抗体无法完全中和时,会引起内毒素入血,导致内毒素血症,然后内毒素经下腔静脉进入右心房,接着进入肺动脉及通过毛细血管灌注到其他器官,但是肺部受到的影响较大[30]。内毒素在肺部会引起大量炎性介质释放,导致慢性炎症形成,直接或间接影响着COPD的病理改变及病情进展。综上,调节及稳定COPD患者的肠道菌群微生态,减少内毒素的释放,对于预防及治疗COPD可能是一种新的途径。目前常见的调节肠道菌群微生态的方法有用营养的方法调整、抗生素调整、活菌制剂的应用等。

3 COPD的肺部微生态与吸烟、大气颗粒的相关研究

3.1 吸烟对COPD的肺部微生态的影响 众所周知,吸烟对于人体的伤害是巨大的,有研究认为,COPD的疾病状态可随着吸烟暴露的程度而变化。吸烟可以加重气道炎症和气道重塑,使气道壁和肺实质发生慢性炎症及结构的破坏,上述改变都可作为微生态失调的微观环境因素。相关研究显示,COPD患者与健康吸烟人群的肺部微生物有明显不同[31-32]。虽然健康吸烟人群和健康非吸烟人群在肺部微生物种群组成中是相似的,但是2组人群的口腔菌群却明显不同。在吸烟者体内,从口腔吸入肺部的微生物种群与炎症的加重有关,当口腔微生物发生变化时,机体不能有效地清除从口腔吸入肺部的微生物,即可导致疾病的发展,这可能就是只有部分吸烟者会患COPD的原因。因此,分析呼吸道微生态对于有吸烟史的COPD患者的早期诊断是有益的。

3.2 大气颗粒对COPD的肺部微生态的影响 近年来,随着人类科技发展的加速,生物燃料使用、工业生产、交通活动及自然因素等综合因素使得人类的环境问题越来越严重,其中大气颗粒物对人类健康的影响也越来越受到人们的关注。颗粒物按其直径大小可分为粗颗粒物、细颗粒物、超细颗粒物。因为呼吸系统与外界相同,所以肺部是大气颗粒物主要作用的靶器官,但具体作用机制尚不明确。但随着肺部微生态认识的不断深入,大气颗粒物暴露对肺部微生态的影响以及在COPD发病机制中的作用开始受到人们的关注[33]。目前已知的致病机制主要是通过炎性损伤、氧化应激、钙稳态失调、免疫损伤、气道高反应性、DNA损伤等机制[34]。当大气颗粒物吸入呼吸道后,通过上述机制使呼吸道原有的生态平衡发生紊乱,失去菌群屏障,菌群的种类发生改变,某些菌种转变为条件致病菌,间接或直接促使COPD的发生发展。Yu等[35]发现,颗粒物的暴露与体内微生物菌群的多样性密切相关,并随着周围颗粒物暴露量以及所处的环境污染程度的增加而增加。目前研究人员越来越多的关注颗粒物与COPD的肺部微生态的相关研究,想进一步探索COPD的发病机制,为COPD的治疗开辟新途径。

4 小结

随着人类疾病的发展,COPD已经成为同高血压、糖尿病 “等量齐观”的最常见的慢性疾病,目前成为世界第3位死因。但是COPD目前的治疗方法仍不是行之有效,依旧无法根治,甚至无法有效延缓疾病进展,所以目前迫切需要从新的角度来了解COPD根本的发生发展机制,来制订新的治疗方法。随着分子生物学的发展,人们逐渐认识到肺部微生态这一概念,相关研究也在进一步探索,但目前尚不能明确肺部微生态在COPD发病机制或治疗方法中的具体作用。相信未来随着技术的发展,当明确COPD发病机制后,随之而来的微生物制剂或是联合其他药物的治疗方法或许有利于COPD患者的防治。

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