铜绿假单胞菌的群感效应及大环内酯类药物的临床治疗研究进展

董颖 程思珺 金丽媛 傅方洁 刘俊秀 陈愉

中国医科大学附属盛京医院呼吸与危重症医学科,沈阳110004

古希腊著名思想家亚里士多德观察到蚂蚁排队搬运食物、鲣鱼遇到危险时会云集的现象,在其 《动物史》一书中首次提出动物社会行为,即动物个体间能够传递信息,当组成群体时可以发挥个体无法实现的作用和功能。关于微生物的社会性在20 世纪60～70 年代才初见端倪。Tomasz[1]发现肺炎链球菌的某个基因可以表达,且仅在细菌增殖达到一定数量时才表达,并快速出现一个高峰,这种基因表达可以通过细菌分泌的一种激素样的小分子在同种细菌间相互传递。该研究是群感效应学说的基石,此后科学家们通过发光细菌确立了该学说,并进行了深入探讨。铜绿假单胞菌是群感效应研究最为深入的细菌,本文就该方面研究进展以及大环内酯类药物的临床治疗作一简要介绍。

1 微生物的群感效应

1.1 群感效应的概念 夏威夷短尾鱿鱼有发光的生物特性,而发光来自于与之共生的费氏弧菌产生的荧光素。Nealson等[2]在1970年通过对海洋发光细菌费氏弧菌的发光机制研究,提出细菌借助自身分泌的小分子物质进行彼此之间的信息交流。细菌是否发光以及发光的强弱与荧光素合成酶基因的表达有关,研究发现细菌数量少时该基因不表达,而在指数生长期细菌增殖达到一定量后基因才被激活,快速合成荧光素酶继而发光,控制荧光素酶的合成是在转录水平。由于该现象无外界干预,而由细胞生长自身所致,故首次提出 “自诱导”的概念[2],传递信息的信号分子被称为自诱导物。1981年应用高效液相色谱法首次从费氏弧菌超亮菌株 (MJ-1)中分离出自诱导物,其化学成分是N-3-氧己酰基-L-高丝氨酸内酯 (3OC6-HSL),人工合成的化合物加入极低亮菌株 (B-61)中能够诱导其发光[3]。

基于对发光细菌的研究,进而扩展到其他细菌。科学家们发现当细菌产生的信号分子达到一定数量且达阈值时,细菌可以在感受到自己以及其他细菌产生的信号后通过调节相关基因表达来调整菌群的整体行为[4],例如细菌能动性、毒力和抗生素的产生[5],这种现象被称为群感效应,是依赖细胞密度的细胞信息交流现象。近年来,随着科学研究的进展,有研究表明群感效应也存在于真菌和病毒中[6-8]。在植物和动物病原体中,群感效应基因突变体毒力明显降低[9-11]。

1.2 群感效应调控通路 对费氏弧菌发光机制的研究揭示了群感效应的经典通路luxI-lux R 系统[12]。在群感效应系统未被激活的情况下,细胞中的信号分子合成酶可以生成少量的信号分子 (自诱导物),这些信号分子可自由通过细胞膜,因其浓度低,不与转录调控蛋白结合[13-14]。伴随着细菌的增殖,当环境中的信号分子数量达到阈值时,会重返细胞内,与转录调控蛋白形成转录调控蛋白信号分子聚合物,该聚合物进一步激活信号分子合成酶基因 (luxI)和转录调控蛋白基因 (lux R),从而合成更多的信号分子,形成正反馈循环,同时激活下游的操纵子和发光基因的表达。多数革兰阴性杆菌群感效应通过luxI-luxR 系统进行调控。其他信号系统还有肽信号系统,涉及多数革兰阳性球菌;部分革兰阴性和阳性菌通过AI-2系统进行调控,用于种系间的交流。自诱导物具有种的特异性,迄今为止,已发现了8种不同化学结构的自诱导物[12]。

2 铜绿假单胞菌的群感效应

2.1 铜绿假单胞菌群感效应的调控通路 铜绿假单胞菌是目前在群感效应方面研究最为深入的致病菌,其群感效应系统被激活后可以调节300多个毒性因子的基因表达[15-16]。铜绿假单胞菌的群感效应核心通路为lasI-lasR 和rhlI-rhlR 2个系统,这2个系统的调节机制与发光细菌相似,此外还有近期发现的喹诺酮类信号分子系统。lasI和rhlI基因是信号分子合成酶基因,lasR 和rhlR 基因是转录调控蛋白基因。当细菌感知信号分子密度达到阈值时,转录调控蛋白与信号分子结合形成聚合物,进一步激活I基因和R 基因以及下游操纵子基因,形成基因表达的正反馈及多种毒性因子的表达。Las系统和Rhl系统的信号分子化学成分以及调控的基因有所不同,Las系统的信号分子是3OC12-HSL,主要调节碱性蛋白酶、外毒素A、弹性蛋白酶等毒性因子的基因表达。Rhl系统的信号分子是C4-HSL,主要调节鼠李糖脂溶血素、几丁质酶、氰化物、绿脓菌素等次级代谢物的产生[17-19]。Rhl系统受Las系统调控。

2.2 铜绿假单胞菌群感效应与生物被膜 目前研究发现微生物的社会行为至少有2种,一种是群感效应,另一种是生物被膜的形成。生物被膜是指当一定数量的细菌聚集在一起时,可由细菌分泌的多糖聚合物形成被膜包绕细菌,对内部细菌起到保护作用,以此抵御外来物入侵,使抗菌药物难以发挥作用,从而造成感染慢性化。铜绿假单胞菌感染后在体内常形成生物被膜,使细菌难以清除。Davies等[20]用铜绿假单胞菌野生株 (WT)、群感效应信号基因突变株 (lasI/rhlI、rhlI、lasI)、lasI突变株+自诱导物对比各组生物被膜形成情况。研究发现WT 株的生物被膜呈结构松散的蘑菇状,内部菌落之间形成水通道,可运输氧气、代谢产物以及营养物质。而lasI突变株形成薄的板层样生物被膜,细胞间连接致密,加入自诱导物 (3OC12-HSL)后恢复WT 株形态。黏附于固体表面是形成生物被膜的重要环节。该研究发现加入洗涤剂十二烷基硫酸钠后,lasI突变株的生物被膜5 min便脱离玻璃表面,而WT 株和lasI突变株加入自诱导物后的生物被膜19 h仍黏附。以上结果说明群感效应系统影响生物被膜的形成[20],是生物被膜上游调控系统之一。

3 大环内酯类药物对铜绿假单胞菌群感效应的作用及临床治疗研究

3.1 大环内酯类药物抑制铜绿假单胞菌群感效应 Tateda等[21]研究发现阿奇霉素可抑制铜绿假单胞菌群感效应系统中lasR/rhlR 基因的转录,加入自诱导物后部分恢复;同时抑制lasI/rhlI的基因表达,使自诱导物3OC12-HSL 和C4-HSL生成减少;导致毒性因子弹性蛋白酶减少,加入自诱导物后也可部分恢复。大环内酯类药物通过抑制铜绿假单胞菌自诱导物的产生,阻断了群感效应,进而抑制了生物被膜的形成及毒性因子的释放[22]。大环内酯类药物具有基本的内酯环结构,按其内酯结构母核上含碳数目不同,可分为14、15和16元环大环内酯。研究发现14元环大环内酯 (红霉素、罗红霉素)、15元环大环内酯 (阿奇霉素)对铜绿假单胞菌的生长具有抑制作用,而16元环大环内酯(交沙霉素、竹桃霉素)没有抑制作用[23]。

3.2 大环内酯类药物对结构性肺病治疗的临床研究 结构性肺病是指导致肺部结构不可逆改变的肺疾病,如支气管扩张症、囊性纤维化 (cystic fibrosis,CF)、COPD、慢性肺脓肿、导致肺结构改变的肺结核等。铜绿假单胞菌是伴有结构性肺病患者肺部感染的常见致病菌,常常导致细菌难以清除、感染慢性化,反复急性感染诱发细菌耐药性增强,使临床治疗困难。铜绿假单胞菌生物被膜的形成以及毒性因子的释放关系到细菌的耐药性和感染的严重性,当铜绿假单胞菌发展成多重耐药菌、泛耐药菌或全耐药菌时,临床可选择的抗菌药物有限甚至无可选择。有多项临床研究评估了低剂量的大环内脂类药物对结构性肺病的临床疗效。新西兰EMBRACE研究是评价阿奇霉素预防非CF 支气管扩张症患者急性加重的随机双盲安慰剂对照研究,入选标准为既往1年内至少1次急性加重需要抗菌药物治疗的支气管扩张症患者,应用阿奇霉素500 mg (3次/周)口服6个月。结果显示,阿奇霉素组急性加重次数为0.59次/人,而安慰剂组为1.57次/人 (P ＜0.000 1),作者提出阿奇霉素是预防支气管扩张症急性加重的新的选择[24]。美国23个中心针对CF铜绿假单胞菌感染的随机对照研究显示阿奇霉素治疗168 d,第1秒用力呼气容积明显改善,未出现急性加重者在阿奇霉素组明显增多[25]。在BLESS研究中,Burr等[26]通过严格筛选进一步对临床分离出的铜绿假单胞菌进行了研究,入选病例为观察结束时患者有痰,铜绿假单胞菌培养阳性,菌株管家基因m RNA 充分表达。安慰剂组15例,红霉素组11例。结果显示,与安慰剂组相比,治疗组分离的铜绿假单胞菌群感效应基因LasR、Pqs A 表达水平降低,从临床角度验证了大环内酯类药物可抑制群感效应。美国17个医疗中心前瞻平行安慰剂对照研究,观察口服阿奇霉素250 mg 1年预防COPD 急性加重的作用,结果显示阿奇霉素组初次加重的中位时间为266 d,安慰剂组为174 d (P ＜0.001);与安慰剂组相比,阿奇霉素组急性加重频率减少 (P =0.01),生活质量评分改善 (P =0.004)[27]。Fan等[28]对非CF患者长期应用大环内酯类药物的疗效进行了荟萃分析,结果显示大环内酯组急性加重次数减少、肺功能改善、生活质量提高,但腹泻症状增加,对大环内酯耐药的流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌较安慰剂组增加 (P ＜0.001)。

3.3 临床治疗指南或共识 2017年欧洲成人支气管扩张症治疗指南中推荐每年急性加重≥3次患者可应用长期抗菌药物治疗 (≥3个月),有慢性铜绿假单胞菌感染者推荐吸入抗菌药物治疗如多黏菌素等,而对吸入药物有禁忌、不耐受、不可行者,推荐大环内酯类药物 (阿奇霉素、红霉素),若吸入抗菌药物仍频繁加重者,推荐加用大环内酯类药物或替换原吸入药物,同时应关注其腹泻及耐药等不良反应[29]。2019版COPD 全球倡议提出阿奇霉素或红霉素长期治疗1年以上可减少COPD 急性加重,但阿奇霉素的治疗与细菌耐药及听力障碍有关[30]。

综上所述,铜绿假单胞菌群感效应机制在其感染过程中影响着毒力及耐药性,大环内酯类药物可抑制群感效应系统,其非抗菌作用在铜绿假单胞菌慢性感染的结构性肺病治疗中发挥一定作用。在应用大环内酯类药物时应掌握其适应证,关注药物不良反应。

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