外泌体miRNA在卵巢癌中的研究进展

2020-03-03张莉袁梦琴王艳清刘诗意杨潇程艳香

国际妇产科学杂志 2020年1期

张莉，袁梦琴，王艳清，刘诗意，杨潇，程艳香

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是妇科肿瘤中致死率最高的一种恶性肿瘤，由于其解剖位置较深，早期无典型的临床表现，大多数患者发现时已属晚期[国际妇产科联盟（FIGO）分期Ⅲ～Ⅳ]，并常伴盆腹腔甚至远处器官的转移。OC的治疗多选择肿瘤切除术并辅以顺铂为基础的化疗，80%患者首次化疗反应良好，但常于6~12个月内复发，导致患者因化疗耐药而死亡。虽然近年来关于OC的研究越来越多，但患者的5年生存率没有明显改善，仍为30%左右[1]。因此，寻找有效的早期诊断标志物和合适的治疗靶点是当前亟需解决的问题。

外泌体（exosome）为直径 30～150 nm 的微泡[2]，富含脂质、蛋白质、RNA和DNA，这些物质源于原始细胞，但表达水平可能与其来源细胞有所不同，表明外泌体在不同状态下可能具有不同的功能[3]。各种细胞均可分泌外泌体，并通过与细胞膜融合将内容物释放到细胞外环境中，介导相邻或远处细胞之间的信号转导[4-5]。目前在大多数体液中发现了外泌体，表明其在体内可以循环。外泌体参与恶性肿瘤的发生、发展，多项研究报道癌细胞比正常细胞分泌更多的外泌体，可调节与肿瘤细胞生物学行为（如增殖[6]、转移[7-8]、耐药[9]和免疫[10]等）相关的广泛生物学过程，其中微小RNA（microRNA，miRNA）扮演了重要角色。研究表明miRNA在肿瘤细胞与正常细胞来源的外泌体中也存在差异性，提示外泌体miRNA（exomiRNA）参与肿瘤的发生、发展。目前与OC相关的exo-miRNA备受关注，现对其研究进展进行综述。

1 外泌体简介

外泌体在1983年被发现[11]，1987年由Johnstone等首次命名为“exosome”，具有经典的“杯”或“碟形”形态[12]。最初学者们认为外泌体是细胞丢弃细胞内废物的方式，但是目前已有大量研究表明外泌体可以介导细胞间信号传导。此外，外泌体在肿瘤患者的血液、尿液、腹水等体液中富集，在肿瘤诊断、疗效监测等方面具有易于获得、简便快捷等优点。随着外泌体分离提取方式的改进与创新，对外泌体的研究日趋增加。

2 exo-miRNA在OC中的作用

外泌体通过将原始细胞内的miRNA传递到受体细胞中，影响肿瘤及肿瘤微环境中基质细胞的生物学行为，从而影响肿瘤的发生、发展。关于exo-miRNA在OC中的研究涵盖了多个方面。

2.1 exo-miRNA参与OC的早期诊断目前多采用盆腔检查、经阴道超声和血清肿瘤标志物糖类抗原 125（CA125）和人附睾蛋白 4（HE4）水平的监测判断OC是否发生或复发。但CA125仅在50%早期OC患者中升高，在70%~90%晚期患者中升高[13]；HE4对OC的诊断也具有限制性，因为其在原发性输卵管癌等多发性腹部肿瘤中的表达也升高[14]。因此，亟需新的诊断标志物。由于miRNA表达紊乱是肿瘤发生的早期事件，miRNA在外泌体中是高度稳定的，不受RNase的影响[15]，因此exo-miRNA可作为许多恶性肿瘤的生物学标志物。

Zhou等[16]收集了39例卵巢浆液性腺癌患者、26例良性妇科疾病患者和30例健康对照者的尿液样本，通过miRNA微阵列分析发现，与健康对照者相比，卵巢浆液性腺癌患者的尿液中只有miR-30a-5p上调，并且尿miR-30a-5p的上调与早期卵巢浆液性腺癌以及淋巴结转移密切相关。此外，当手术切除肿瘤组织时，来自OC患者的尿miR-30a-5p明显减少，提示尿miR-30a-5p可反映肿瘤负荷。该研究同时检测到胃癌和结肠癌患者尿液中miR-30a-5p的表达水平较低，提示尿miR-30a-5p的上调可能对卵巢浆液性腺癌的诊断具有特异性。miR-30a-5p在来自OC细胞上清液的外泌体中也富集，支持exomiR-30a-5p排泄到尿液中的途径。

Su等[17]发现miR-1307和miR-375稳定存在于OC患者的血清外泌体中，与卵巢良性肿瘤和健康对照组相比，两者表达均显著上调。当miR-1307、miR-375与CA-125和HE4联合时具有更高的诊断能力，可成为区分良性与恶性的标志物。此外，miR-1307和miR-375还分别与肿瘤分期和淋巴结转移正相关。

Li等[18]从10例腹腔转移的OC患者和良性疾病对照组中分离出腹膜液中的外泌体，通过新一代测序法以寻找表达差异的miRNA，并通过GO和KEGG通路富集分析进行差异miRNA的靶基因分类，结果发现miR-149-3p和miR-222-5p表达上调，通过Kaplan-Meier法分析发现两者与患者5年生存率和总生存率呈正相关，表明miR-149-3p和miR-222-5p可能是评估OC患者预后的新型生物学标志物。

Hang等[19]通过分析13种OC细胞系和3株正常细胞系及其上清液中外泌体的miRNA表达差异发现，OC细胞系与OC细胞来源的外泌体共享16种上调和6种下调的miRNA。在这些差异性miRNA中，hsa-miR-145-5p在OC中表达降低，其低表达与预后不良和分期较高显著相关。在OC及其外泌体中hsa-miR-145的表达降低可能是诊断和治疗OC的关键生物学标志物。Kobayashi等[20]发现与健康对照组相比，OC患者血清中miR-1290显著过表达，并且在OC晚期miR-1290的表达高于早期。此外，术后miR-1290表达显著下降，提示miR-1290可反映肿瘤负荷。该研究还发现，与非上皮性OC相比，miR-1290在上皮性OC中高表达，提示其与组织类型有关。受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析显示，miR-1290与CA125的特异度和敏感度没有显著差异。因此，exo-miR-1290可作为一种新的潜在的诊断OC的生物学标志物。

2.2 exo-miRNA参与免疫肿瘤免疫微环境对于OC的进展是至关重要的，主要是由肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）和T细胞如调节性T细胞（Treg）和T辅助细胞17（Th17）组成，TAMs占多数，并在肿瘤生长、侵袭、血管生成和转移中发挥重要作用[21]。通常，TAMs被认为是M2型巨噬细胞，具有抗炎和原始肿瘤表型，在重塑肿瘤免疫微环境中发挥重要作用[22]。

Zhou等[23]和Wang等[24]研究发现OC患者的腹膜中含有丰富的免疫细胞，TAMs约占70%，T细胞约25%，其中Treg/Th17比值在OC原位和转移性腹膜组织中显著高于良性卵巢肿瘤和良性腹膜，而且Treg/Th17比值与组织学分级相关，是OC患者总体生存率的独立预后因素。通过进行TAMs来源外泌体的miRNA微阵列分析发现，miR-29a-3p和miR-21-5p在外泌体中富集。将M2型巨噬细胞来源的外泌体与CD4+T细胞共培养，Treg/Th17比值增加，并且miR-29a-3p和miR-21-5p的靶基因STAT3表达下调，两者对STAT3具有协同抑制作用。STAT3参与CD4+T细胞向Treg或Th17细胞的分化，并促进白细胞介素 10（IL-10）的表达，降低 IL-4、IL-6 和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达水平[25]。这表明miR-29a-3p和miR-21-5p可能共同引起OC免疫微环境的不平衡，最终导致肿瘤进展。

Wu等[26]从OC患者腹水中分离TAMs并培养，随后从TAMs上清液中提取外泌体，与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）共培养，可明显抑制HUVECs迁移，并且miR-146b-5p在HUVECs中表达升高。此外，TAMs来源的外泌体和SKOV3来源的外泌体联合刺激HUVECs，并克服了由TAMs来源的外泌体引起的内皮细胞迁移的抑制。提示TAMs来源的外泌体在OC的血管生成中具有抑制作用，但可被OC细胞来源的外泌体抵消。

Hu等[27]观察到TNF超家族的成员之一——TNF样弱凋亡诱导因子（tumor necrosis factor like weak inducer of apoptosis,TWEAK）刺激巨噬细胞分泌的外泌体可被OC细胞内吞并抑制细胞转移。通过miRNA微阵列分析，共发现有19种miRNA在用或不用TWEAK处理的巨噬细胞来源的外泌体中差异表达。TWEAK不仅使巨噬细胞及其分泌的外泌体中miR-7的水平升高，还导致受体OC细胞中miR-7水平升高，降低细胞转移能力。向TAMs中预先转染antagomiR-7可显著降低巨噬细胞及其分泌的外泌体以及受体细胞中miR-7的水平，同时癌细胞转移能力增强。表明TAMs来源的exo-miR-7参与调节OC细胞转移。

Zhu等[28]发现缺氧OC细胞募集巨噬细胞，并诱导巨噬细胞成为TAM；反之，缺氧巨噬细胞来源的外泌体可促进OC细胞的恶性表型，miR-223在缺氧巨噬细胞来源的外泌体中富集，可转移至共培养的OC细胞，增强癌细胞的耐药性。并且与低表达缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的OC患者相比，高表达HIF-1α患者具有统计学上更高的CD163+细胞浸润和miR-223的水平。提示exo-miR-223水平与OC的复发密切相关。Chen等[29]发现缺氧可诱导miR-940在OC细胞来源的外泌体中高表达，促进巨噬细胞向M2型转化，进一步诱导OC细胞增殖和迁移。

2.3 exo-miRNA参与OC细胞的耐药 exo-miRNA可能影响癌细胞对化疗药物的敏感性，如Lasagna等[30]发现miR-501-5p在对阿霉素耐药的胃癌细胞SGC7901/ADR来源的外泌体中富集，其可传递至敏感细胞SGC7901，进而促进细胞耐药。化疗耐药是OC治疗的主要障碍，如何提高患者对药物的敏感性是亟需解决的问题。

晚期OC细胞通常扩散到网膜内脏脂肪组织。Au Yeung等[31]使用新一代测序法发现，从肿瘤相关脂肪细胞和成纤维细胞分离的外泌体和组织裂解物中的miR-21水平显著高于OC细胞。exo-miR-21从肿瘤相关脂肪细胞或成纤维细胞转移到OC细胞，可抑制OC细胞凋亡，促进OC细胞耐药。因此，抑制基质细胞miR-21的转移可能是OC转移和复发治疗中的一种有效方式。

Kanlikilicer等[32]发现miR-6126在来自化疗敏感（HeyA8，SKOV3-ip1，A2780）和耐药 OC 细胞（HeyA8-MDR，SKOV3-TR，A2780-CP20）的外泌体中表达均显著升高。exo-miR-6126过表达与OC患者的生存期较长和预后较好呈正相关，且miR-6126的高表达抑制OC细胞耐药，并降低癌细胞增殖和转移的能力，提示OC细胞通过外泌体将miR-6126从胞内排出，维持细胞耐药。此外，Kanlikilicer等[33]还发现miR-1246在OC细胞来源的外泌体中大量表达，miR-1246在紫杉醇耐药性OC细胞来源的外泌体中的表达显著高于敏感株，当OC细胞与巨噬细胞共培养时，它们能够将exo-miR-1246转移到M2型巨噬细胞，进而影响肿瘤免疫抑制微环境的形成，促进OC进展。

Weiner-Gorzel等[34]发现 miR-433在 A2780细胞中过表达，并且可诱导细胞衰老。进一步在miR-433表达水平更高的PEO1和PEO4细胞中进行验证，发现在紫杉醇处理后生存的PEO1和PEO4细胞中miR-433表达水平各上调15倍和12倍，但紫杉醇处理后细胞miR-433的表达未增加，说明miR-433在紫杉醇处理后存活的细胞中富集可能与细胞衰老有关。此外，通过将高表达miR-433的细胞来源的外泌体与A2780细胞共孵育，发现miR-433在A2780细胞中表达更高，并且细胞凋亡减少，对紫杉醇的耐药性提高，提示miR-433通过诱导细胞衰老效应促进OC细胞对紫杉醇的耐药。

2.4 exo-miRNA参与OC增殖、凋亡和迁移 Zhang等[35]发现与正常卵巢组织相比，miR-124在OC组织中表达下调，并且在肿瘤相关成纤维细胞中的表达低于正常成纤维细胞。将人卵巢表面上皮细胞来源的exo-miR-124转移至肿瘤相关成纤维细胞，导致肿瘤相关成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白和成纤维细胞活化蛋白表达降低，细胞迁移能力减弱，而OC细胞来源的外泌体转移至正常成纤维细胞后，促进正常成纤维细胞表现出肿瘤相关成纤维细胞的特征。提示miR-124可能是治疗OC的新靶点。

Pan等[36]从106例OC患者、8例卵巢囊腺瘤患者和29例健康女性血浆中提取外泌体，随后使用含有48种miRNA的TaqMan探针法测定miRNA表达谱，发现与健康女性相比，miR-21、miR-100、miR-200b和miR-320在OC患者中表达显著升高，miR-16、miR-93、miR-126和 miR-223的表达显著降低。进一步观察外泌体中的miR-200b和miR-320对卵巢增殖和凋亡的影响发现，miR-200b在SKOV3中作用不明显，但在OVCAR3细胞中抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，并且效果优于喜树碱；而miR-320虽然在OC细胞来源的外泌体中过表达，但对细胞增殖和凋亡没有显著影响。此外，外泌体中miR-200b的表达水平与患者总体生存率相关。

Xu 等[37]检测了 6 种候选 miRNA（miR-101、miR-21、miR-210、miR-30a、miR-34a 和 miR-125b）在 36例OC患者癌组织、癌旁组织以及血清外泌体中的表达水平，发现与癌旁组织相比，癌组织中有4种miRNA（miR-101和 miR-30a下调；miR-21和miR-210上调）表达具有差异，而在OC患者和健康对照者的血清中仅有miR-101表达水平有差异，且miR-101低表达可促进癌细胞迁移。因此检测血清外泌体中的miR-101含量可作为OC的潜在诊断标志物。

Yoshimura等[38]发现与良性肿瘤患者与健康志愿者相比，OC患者血清miR-99a-5p水平显著升高。患者术后血清miR-99a-5p表达水平显著降低，表明miR-99a-5p可反映肿瘤负荷。采用OC细胞来源的外泌体处理人腹膜间皮细胞（human peritoneal mesothelial cells，HPMCs）可显著增加其 miR-99a-5p表达，反之高表达miR-99a-5p的HPMCs促进OC侵袭。此外，ROC曲线分析显示，miR-99a-5p和CA125的ROC曲线下面积（AUC）之间没有显著差异；当CA125与miR-99a-5p组合时，作为诊断标记物的作用显著增强。