二维斑点追踪技术评价牛磺酸对宫内发育迟缓大鼠心功能的影响

赵秋霞，刘 蓉*，刘朝奇，董芝芝，陈 悦

(1.三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院超声科，湖北 宜昌 443003；2.三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

宫内发育迟缓(intrauterine growth restriction， IUGR)是指出生时体质量低于同孕龄同性别胎儿平均体质量2个标准差或第10百分位数，或孕37周胎儿体质量小于2 500 g[1]，是围产儿死亡的重要原因之一，在美国发生率约10%，在我国发生率约8.8%[2-3]。IUGR与成年后心血管疾病密切相关[4]，早期干预治疗可降低晚年患心血管疾病的风险[5]。研究[6]表明牛磺酸可对抗心肌缺血/再灌注损伤。通过追踪心肌自然声学斑点，利用斑点追踪技术(speckle tracking imaging， STI)可客观、定量评价心肌运动及形变，较准确地评价局部和整体心功能[7]。本研究应用二维STI评价牛磺酸对IUGR大鼠心功能的影响。

1 资料与方法

1.1 IUGR动物模型建立 体质量250～260 g SD大鼠16只(雄性6只，10只雌性无交配史)，由三峡大学动物实验中心提供。对雌鼠每日下午6时进行阴道涂片。将处于发情期的雌鼠与雄鼠按2:1随机合笼1晚，次日晨8时行阴道涂片检测，以阴道栓或光学显微镜下观察发现精子作为妊娠第1日，单笼喂养孕鼠。妊娠第1天起，随机选择2只孕鼠给予正常饮食，其幼鼠出生后纳入正常对照组；另8只孕鼠给予限制蛋白饮食[8]，幼鼠出生后称重，将出生体质量低于正常对照组平均体质量2个标准差的幼鼠定义为IUGR。IUGR幼鼠出生后随机分为IUGR组、IUGR+低剂量牛磺酸组(低剂量组)及IUGR+高剂量牛磺酸组(高剂量组)，每组各9只。后2组幼鼠出生后开始灌胃给予牛磺酸(低剂量组每日200 mg/kg体质量，高剂量组每日400 mg/kg体质量)，正常对照组、IUGR组给予200 mg/kg体质量生理盐水。

1.2 左心室功能检测 采用Philips EPIQ 7C超声诊断仪，S8-3(频率3～5 MHz)探头。称取出生4周大鼠体质量，用10%水合氯醛以0.4 ml/100 g剂量行腹腔注射麻醉后，胸部备皮，仰卧保定于平板上，连接肢体导联心电图。采集左心室乳头肌水平稳定心律下连续10个心动周期的二维动态图像，输入Philips QLab工作站进行脱机后图像处理分析，在收缩末期或收缩中期手动勾勒心内膜和心外膜，目测并反复调整直至最佳追踪，获得左心室局部周向峰值应变，测值取10个心动周期的平均值。

1.3 HE染色检测 结束上述检查后处死大鼠，依次完成心脏取材、脱水、包埋、切片。先行Harris苏木素染色3～8 min，再用1%盐酸酒精分化数秒，然后0.6%氨水返蓝，最后将切片入伊红染液中染色1～3 min后脱水透明，从二甲苯中取出稍晾干后用中性树胶封片。光学显微镜下，细胞核为蓝色，细胞质为红色。

1.4 心肌组织Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达量检测 采用免疫组织化学方法。以10%中性甲醛溶液固定大鼠心肌组织，制作成蜡块，切片厚度4 μm，正常血清工作液试剂封闭，滴加适当比例稀释的一抗(Ⅰ型胶原抗体稀释比例为1∶200；Ⅲ型胶原抗体稀释比例为1∶300)；二抗为通用型辣根过氧化物酶标记抗体，二氨基联苯胺法(DAB法)显色，苏木素染色后脱水封片。光学显微镜下，苏木素染细胞核为蓝色，棕黄色为DAB显出阳性表达。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。用±s表示计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量情况 出生时，与正常对照组相比，3组幼鼠体质量均明显减低(P均<0.05)。出生4周，与正常对照组相比，IUGR组体质量无明显改变(P>0.05)。与IUGR组相比，低剂量组、高剂量组幼鼠体质量均无明显改变(P均>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量及局部周向应变情况(±s)

表1 各组大鼠体质量及局部周向应变情况(±s)

分组出生时体质量(g)4周后体质量(g)局部周向峰值应变(%)IUGR组(n=9)41.23±1.27∗242.31±1.94-5.13±1.29∗低剂量组(n=9)40.92±1.51∗241.58±1.71-8.77±1.53△高剂量组(n=9)41.31±1.49∗241.92±1.68-11.28±2.69△#正常对照组(n=9)49.12±2.14242.14±2.53-10.16±2.15F值56.6770.59416.387P值<0.0010.623<0.001

注：*:与正常对照组比较，P<0.05；△：与IUGR组比较，P<0.05；#：与低剂量组比较，P<0.05

图2 出生4周各组大鼠心肌细胞(HE，×400) A.正常对照组； B.IUGR组心肌细胞较正常对照组数量减少，体积增大； C. 相比IUGR组，低剂量组心肌细胞较数量无明显改变而体积减小； D.高剂量组数量无明显改变，体积减小更著

2.2 二维STI评价牛磺酸对IUGR大鼠心功能的影响 出生时受幼鼠心脏体积限制，无法采集乳头肌水平短轴切面动态图像。出生4周后，与正常对照组相比，IUGR组左心室局部周向峰值应变显著降低(P<0.05)。与IUGR组相比，低剂量组和高剂量组左心室局部周向峰值应变显著增高(P均<0.05)。与低剂量组相比，高剂量组左室局部周向峰值应变显著增高(P<0.05)。见表1、图1。

2.3 牛磺酸对IUGR大鼠心肌细胞影响 与正常对照组相比，IUGR组大鼠心肌细胞数量减少、体积增大。与IUGR组相比，低剂量组和高剂量组心肌细胞数量无改变而体积减小。见图2。

2.4 大鼠心肌Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达情况 与正常对照组相比，IUGR组Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达增高。与IUGR组相比，低剂量组、高剂量组Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达减低，高剂量组更著。见图3、4。

图1 出生4周各组大鼠左心室纵向峰值应变 A.正常对照组左心室局部周向峰值应变-10.0%； B.IUGR组左心室局部周向峰值应变-4.1%； C.低剂量组左心室局部周向峰值应变-7.7%； D.高剂量组左心室局部周向峰值应变-11.8%

图3 出生4周各组大鼠心肌Ⅰ型胶原表达(免疫组织化学，×400) A.正常对照组心肌； B.IUGR组心肌Ⅰ型胶原表达较正常对照组增多； C.相比IUGR组，低剂量组心肌Ⅰ型胶原表达减少； D.相比IUGR组，高剂量组心肌Ⅰ型胶原表达减少

图4 出生4周各组大鼠心肌Ⅲ型胶原表达(免疫组织化学，×400) A.正常对照组； B.IUGR组Ⅲ型胶原较正常对照组增多； C.I低剂量组Ⅲ型胶原表达较IUGR组减少； D.高剂量组Ⅲ型胶原表达较IUGR组减少

3 讨论

IUGR新生儿更易发生窒息、低氧血症、胎粪吸入综合征、酸中毒及低血糖等，是围生期死亡和长期发病的主要原因，IUGR患儿围产儿死亡率是健康围产儿的4～6倍[1.9]。研究[10]发现，产前子宫内慢性缺氧、营养不良、胎盘血管阻力增加等因素可导致胎儿心脏压力和容积超负荷，使胎儿形成适应机制，继而诱发心血管重构，可能是成人心血管死亡率升高的主要机制之一。牛磺酸在哺乳动物细胞中具有渗透调节、抗炎、钙离子处理、氧化应激和线粒体蛋白合成调控等功能，是心肌细胞内含量最丰富的游离氨基酸，对心脏具有正性肌力作用[11]。

本研究发现，与正常对照组相比，IUGR组大鼠出生时体质量显著减轻；出生4周后，与正常对照组相比，IUGR组体质量无明显改变，与IUGR组相比，低剂量、高剂量组体质量无明显改变，主要原因可能是限制生长的因素去除后，IUGR大鼠会表现出生长速度增加，即追赶生长现象。上述结果提示，补充营养物质可促进IUGR大鼠生长发育[12]，而牛磺酸的效果并不明显。

二维STI无角度依赖性，不受前后负荷影响，能早期准确检测局部及整体心肌运动功能[7]。本研究发现，与正常对照组相比，IUGR大鼠左心室局部周向峰值应变减低，提示IUGR大鼠局部心功能发生改变；低剂量牛磺酸能够增加IUGR大鼠左心室局部周向峰值应变，而高剂量牛磺酸组左心室局部周向峰值应变更接近正常对照组，表明牛磺酸能改善局部心肌运动功能，以高剂量为著。ITO等[13]发现，敲除大鼠牛磺酸转运体基因导致的牛磺酸缺乏可导致大鼠心功能降低，也提示心功能改变可能与牛磺酸相关。

本研究发现IUGR大鼠发生心脏重构，与SCHIPKE等[9]的结果一致。心脏重构主要为心肌细胞及细胞外间质发生改变。心肌细胞重构主要是心肌细胞数量和体积的改变，细胞外间质重构主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原重构。Ⅰ型胶原含量最多，约占心肌胶原总量的80%。Ⅰ型及Ⅲ型胶原均能维持心脏结构和功能的完整性。心肌发生重构后，Ⅰ型胶原增加可使心肌僵硬度增加，而Ⅲ型胶原增加则可提高心肌顺应性。出生4周后，与正常对照组相比，IUGR组大鼠心肌细胞减少、体积增大，Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达增高，表明IUGR大鼠发生了心脏重构，而心肌细胞数量减少可能通过心肌细胞肥大加以代偿[10]。补充牛磺酸后，与IUGR组相比，低剂量组与高剂量组心肌细胞数量无明显变化，体积减小，Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达下降，表明牛磺酸能延缓心肌代偿，抑制Ⅰ型及Ⅲ型胶原合成，起到抗心肌纤维化、抑制心肌重构作用，高剂量牛磺酸效果更好。牛磺酸影响心功能的潜在生化机制可能是通过调节肌浆网Ca2+的储存能力，影响钙激活ATP泵的泵送速率或离子通道[14]；此外，有报道[15]称牛磺酸具有强大的抗氧化作用，可能在心功能改变中发挥积极作用。

综上所述，本研究发现牛磺酸能提高大鼠左心室局部周向峰值应变，抗心肌纤维化，400 mg/kg体质量牛磺酸干预治疗效果更佳。本研究主要不足在于受探头及大鼠心脏体积的限制，仅分析了出生4周的大鼠左心室局部周向峰值应变，未检测分析径向及纵向应变，且牛磺酸对IUGR大鼠心功能影响的具体机制尚需进一步观察。