‘禾荔’优质晚熟突变体‘GLL-1’类黄酮糖基转移酶基因LcUFGT的克隆与表达分析

张树伟 彭宏祥

摘 要：‘GL为‘禾荔中选育出的一个优质晚熟芽变新种质。为探讨‘GL果实成熟期延迟的遗传基础，该研究以‘禾荔和‘GL为实验材料，克隆花色素苷合成途径结构基因LcUFGT，并对其进行生物信息学预测及分析，同时通过qRT-PCR对LcUFGT基因在果实发育不同阶段的表达进行研究，分析LcUFGT的表达对突变体果实发育速度的影响。结果表明：（1）LcUFGT基因ORF长1 359 bp，编码453个氨基酸，推测蛋白质分子量约为50.16 kD。（2）序列比对发现所编码蛋白与‘禾荔等荔枝品种高度保守，在蛋白的C端具有PSPG盒。（3）在果实发育成熟进程中，‘禾荔和‘GL果皮逐渐退绿转红，两者LcUFGT基因的表达量都呈先上升后下降的表达趋势，然而，‘禾荔 LcUFGT基因的表达量在花后56 d显著增加，突变体‘GL LcUFGT基因的表达量在花后67 d显著增加，LcUFGT基因在突变体‘GL中显著上升表达的时间比‘禾荔延迟，且与果实发育延迟基本一致。以上结果表明，LcUFGT基因在荔枝果皮着色过程中发挥重要作用，是果实着色的关键基因之一，突变体‘GL中的延迟表达是引起突变体晚熟的原因之一。

关键词：晚熟突变体，LcUFGT基因，果实发育，花色素苷合成，表达分析

中图分类号：Q943文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）01-0128-08

Abstract：‘GL is an excellent late-maturing bud sport germplasm，which was selected from ‘Heli. To reveal the genetic basis of late-maturing，in this study，‘Heli and ‘GL were used as the materials. The LcUFGT which is a structural gene of anthocyanin synthesis pathway was cloned and analyzed by bioinformatic methods. The corelation between LcUFGT and the character of late-maturing in ‘GL and  the expression of LcUFGT during the development of litchi fruit were analyzed by qRT-PCR. The results were as follows：（1） ORF of LcUFGT gene was 1 359 bp，which encoded 453 amino acids with the molecular weight of 50.16 kD. （2） LcUFGT gene was conservative in ‘GL and other litchi cultivars，and a PSPG box existed in the C-terminal. （3） With the development of litchi fruit，the color of pericarp began to turn from green to red; the expression of LcUFGT was increased and then decreased in both ‘GL and ‘Heli; the expression of LcUFGT was obviously increased at 56 d and 67 d after flowering of ‘Heli and ‘GL，respectively; the expression of LcUFGT had a delayed increase in ‘GL than that of ‘Heli，which was consistent with the late-maturing of fruits. It is supposed that LcUFGT plays an important role in color changes of pericarp，and it is one of the key genes to regulate coloration of pericarp. At the same time，the delay-expression of LcUFGT maybe the main reason of late-maturing of ‘GL.

Key words：late maturity mutant，LcUFGT，fruit development，anthocyanin synthesis，expression analysis

荔枝（Litchi chinensis）是我國华南地区种植面积最大的木本果树，是华南地区农民经济收入的主要来源之一。目前，生产上缺乏特早熟和特晚熟优质荔枝品种，造成荔枝集中在六七月份成熟上市，产期过于集中，造成农民丰产而不丰收。‘禾荔是广西传统的栽培品种，品质优良，并且丰产、稳产，突变体‘GL不仅保留了‘禾荔的优良特性，而且成熟期延迟，较‘禾荔晚熟15 d（李平等，2016），是调节荔枝品种栽培结构拉长鲜果供应期的优异资源，同时也是荔枝熟期育种及果实发育理论研究的重要材料。

‘GL一个最重要突变特征是其果皮着色显著延迟，成熟期延后。荔枝果皮着色是一个花色苷合成积累的过程，最终果皮呈现出鲜艳的红色。自然界中花色苷以稳定的花青素的配糖体形式存在，常见的有六种：花葵素（pelargonidin）、矢车菊素（cyanidin）、飞燕草素（delphinidin）、芍药素（peonidin）、矮牵牛花色素（petunidin）和锦葵色素（malvidin）（王延玲等，2012;李金星和胡志和，2013;肖长城等，2014）。荔枝果皮中的花色苷主要是矢车菊素-3-芸香糖苷（刘亮等，2013）。

植物花色苷合成途径已经明确，在苯丙烷类代谢的基础上经由类黄酮合成途径完成。涉及的结构基因依次有苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）、查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）、查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）、黄烷酮3-羟化酶（Flavanone 3-hydroxylase，F3H）、二氢黄酮醇还原酶（Dihydroflavonol reductase，DFR）、花色素苷合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）和类黄酮-3-O-糖基转移酶（UDP glucose：flavonoid 3-O-glycosyl transferase，UFGT）等（Winkel-Shirley，2001）。在荔枝中UFGT酶活性与果皮花色素苷合成显著正相关，LcUFGT是荔枝果皮红色形成的关键基因（王惠聪等，2004;Li et al.，2016）。花色苷的生物合成受遗传因素和环境因素共同影响，遗传因素主要影响花色苷合成的种类和合成的时间。突变体‘GL与‘禾荔有高度相似遗传背景，但是果实成熟期显著不同，本研究从‘GL中分离UFGT基因，探讨‘GL果实成熟延迟的遗传基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为‘禾荔和其芽变‘GL，样品采自桂平市麻垌镇（芽变发现地），样品为果实发育不同时期的果皮（花后30、42、56、67和79 d），采摘洗净后将果皮放入锡纸袋，液氮速冻带回实验室，-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 荔枝果皮总RNA提取和cDNA合成

果皮总RNA提取采用华越洋植物总RNA提取试剂盒（北京），用RNA free DNase（TaKaRa）消化DNA残留，分别用1.0%琼脂糖凝胶和全自动核酸蛋白分析仪检测RNA纯度和浓度，cDNA第一链的合成采用Invitrogen的cDNA逆转录试剂盒，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.3 LcUFGT基因的获得

根据NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）登入的荔枝UFGT基因序列信息（GenBank No. HQ402914），用Primer Premier 5.0 软件设计引物P1U和P1L（表1），以合成的cDNA第一链为模板，用ExTaq酶（TaKaRa）扩增。具体PCR反映体系和扩增程序参照产品说明书。PCR产物检测纯化后克隆到pMD20-T载体，进行测序。

1.4 LcUFGT基因生物信息学分析

NCBI ORF finder（（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/）在线分析LcUFGT的开放阅读框，用ExPASy ProtParam在线工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析LcUFGT的理化性质，用Wolf PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在线预测LcUFGT蛋白的定位。利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽分析。用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线工具预测其跨膜结构域，通过NCBI中BLAST（（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）工具进行同源性比对分析，用DNAMAN software（version 5.2.2.0）软件进行多序列比对，利用MEGA5.0采用邻近相接法（neighbour joining）步长值1 000构建系统进化树。

1.5 LcUFGT基因的表达水平分析

根據获得的LcUFGT基因序列，用Primer Premier 5.0 软件设计定量引物（表1），Real-Time PCR反应在罗氏LightCycler 480 system上完成，试剂采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix （Takara），反应体系20 μL，反应程序如下：95 ℃，60 s;95 ℃，15 s;55 ℃，20 s;72 ℃，30 s;40个循环。以LcActin作为内参基因，每个样品3次重复，运用2-ΔΔCT （Livak & Schmittgen，2001）计算LcUFGT基因的表达水平。

2 结果与分析

2.1 LcUFGT基因的克隆

经检测，从果皮提取的总RNA质量较好，A260/A280比值在1.80～2.0之间，电泳检测条带清晰无降解（图1）。逆转录合成第一链cDNA用于克隆LcUFGT基因，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，可见一条清晰条带（图1），纯化后连接到pMD20-T载体，转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选克隆测序，获得荔枝LcUFGT基因序列信息（图2）。

2.2 LcUFGT基因的序列分析

荔枝LcUFGT同源基因ORF长1 359 bp，编码453个氨基酸，用ExPASy ProtParam在线工具预测LcUFGT蛋白分子式为C2266H3549N607O643S18，相对分子质量是50 160.87，等电点为7.70，脂溶指数为91.04，是脂溶性蛋白，不稳定指数为44 053，属于不稳定蛋白，亲水性指数为-0.067，是疏水性蛋白。用Wolf PSORT在线工具预测LcUFGT蛋白定位在细胞质。SignalP 4.1 Server在线预测表明该蛋白不存在信号肽。用TMHMM Server v. 2.0在线工具预测其跨膜结构域，结果表明LcUFGT蛋白无跨膜区。可以推测，LcUFGT蛋白合成后不经转运，在细胞质中行使催化功能。

在蛋白数据库中对LcUFGT序列进行blast，结果显示荔枝LcUFGT与草莓（Q66PF5）、白梨（A0A0A0P547）、苹果（Q9XES4）、山葡萄（B6DU53）、蓝莓（X5HZM4）、樱桃（F2VR51）、葡萄柚（C5MR71）和克里曼丁橘（V4TSJ3）等的一致性在53%～61%之间。LcUFGT具有TDP结合位点，其三维结构类型为GT-B类，在C-端具有一个由44个氨基酸残基组成的PSPG盒，PSPG盒是糖基转移酶结合糖基供体的区域，其中第22位、第23位和第44位氨基酸在选择糖基供体中发挥重要作用，LcUFGT的PSPG第22位为色氨酸，可定位UDP-葡萄糖，第23位丝氨酸在UDP-葡萄糖醛酸转移酶中保守性强，第44位谷氨酰胺在葡萄糖糖基转移酶中保守性很强，推测LcUFGT以UDP-葡萄糖为主要糖基供体的葡萄糖基转移酶（图3）。

用MEGA5.0邻近相接法对LcUFGT蛋白及其他物种UFGT进行系统进化树分析，从图4可以看出，荔枝LcUFGT同源性最高，与柑橘类葡萄柚、甜橙和克里曼丁橘的UFGT有较近的亲缘进化关系;来自同一科的UFGT进化关系较近，蔷薇科草莓、梨、苹果、月季和樱桃等UFGT聚为一类;山葡萄、圆叶葡萄和河岸葡萄的UFGT聚为一类。

2.3 LcUFGT基因的表达分析

UFGT是荔枝果皮花色素苷合成的关键酶之一，荧光定量分析显示结果见图5。‘GL突变体和‘禾荔中，LcUFGT均随荔枝果实发育和着色增加表达量先上升后下降，在果实发育前期表达量维持较低水平，果实发育进入转色期表达量显著增加，接近成熟时表达量显著降低。花后56～67 d是‘禾荔果实花色苷快速积累的时期，此时LcUFGT表达量显著增加;‘GL突变体果实着色延迟，LcUFGT的表達也延迟到67 d显著增加。因此，LcUFGT的表达与‘禾荔、‘GL的果实着色进程一致，推测‘GL果实着色延迟与LcUFGT的表达延迟有关。

3 讨论与结论

荔枝LcUFGT蛋白含有453个氨基酸残基，是一种存在于细胞质基质的非分泌型蛋白，有类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶保守序列PSPG盒，该保守序列是糖基供体的结合域，LcUFGT的PSPG盒第22位色氨酸，说明其糖基供体主要是UDP-葡萄糖。LcUFGT在进化关系上与柑橘类葡萄柚、甜橙和克里曼丁橘较近，但是是否具有相同的功能，还有待进一步研究。

‘GL突变体果实发育迟缓，较母株果实成熟期延迟15 d左右，而荔枝果实成熟的主要标志之一即为果皮花色苷的积累。UFGT是花色素苷合成的最后一个关键酶，使不稳定的花青素转变成稳定的花青苷，苹果、梨、草莓和葡萄等果树中，UFGT活性与花色素合成显著正相关（Kobayashi et al.，2001; Griesser et al.，2008; Onik et al.，2018），抑制荔枝果皮UFGT酶活性可以抑制花青苷合成。已有研究结果表明，桂味荔枝果皮中，LcUFGT的表达量呈直线增加，在采收时略微降低（魏永赞等，2014）;妃子笑LcUFGT的表达量随着果皮颜色加深表达量逐渐增加（Wei et al.，2011）;糯米糍LcUFGT基因在红色果皮和嫩叶中表达量高于其他绿色组织，并且LcUFGT表达量随果实发育逐渐增加，LcUFGT与荔枝果皮着色进程显著正相关（王惠聪等，2004;Wei et al.，2011;Lai et al.，2014）。本研究与前人研究结果一致，‘禾荔及其突变体‘GL的果皮中LcUFGT表达趋势与果皮着色进程正相关，随着果实发育进入转色期，LcUFGT表达量增加，并且‘GL突变体LcUFGT表达上升期比‘禾荔延迟，与果实发育延迟一致。因此，我们推测，LcUFGT是‘GL突变体果实发育延迟的关键基因之一。

VvUFGT是葡萄花色苷合成的关键酶，白色和红色葡萄浆果的发育过程中，检测花色苷合成相关基因的表达发现VvUFGT仅在红色品种中表达（Boss et al.，1996），进一步研究发现白色和红色葡萄品种的UFGT基因序列没有差异，这可能与VvUFGT的调控基因变异有关（Kobayashi et al.，2001，2002）。本研究从‘禾荔及其突变体‘GL中克隆LcUFGT基因，两者序列一致性100%，没有变异。花色素苷的合成受到结构基因和调控基因的协同调控，需要进一步研究LcUFGT的上游调控基因，找到LcUFGT基因表达上升期延迟的原因，为研究‘GL果实成熟期延迟的遗传基础奠定基础。

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（责任编辑 何永艳）