荧光蛋白及其在微生物过程工程中的应用研究

刘轩卓

摘  要：荧光蛋白（Fluorescentprotein）的分离应用为现代工业的发展起到了至关重要的作用，其是一类可在紫外光激发下产生荧光的发光蛋白，较为常见的有绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein，简称GFP）、蓝色荧光蛋白（Bluefluorescentprotein，简称BFP）、青色荧光蛋白（Cyanfluorescentprotein，简称CFP）、黃色荧光蛋白（Yellowfluorescentprotein，简称YFP）、红色荧光蛋白（Redfluorescentprotein，简称RFP）等。荧光蛋白的荧光稳定性较好，而且灵敏度很高，因此应用较为广泛，尤其是在生物学的众多领域都有应用。本文将从荧光蛋白的基础理论、在微生物过程工程中的应用现状包括应用范围、应用方法以及未来的发展趋势等方面做综述，为后续荧光蛋白更加广泛的应用提供一定的参考。

关键词：荧光蛋白  微生物  过程工程  应用研究

中图分类号：Q93                                 文献标识码：A                     文章编号：1674-098X（2020）08（b）-0091-03

Abstract： Fluorescent protein separation application plays a vital role for the development of modern industry. It is a kind of Fluorescent protein that can produce fluorescence under UV excitation. More common are Green fluorescent protein （GFP）， Blue fluorescent protein （BFP）， Cyan fluorescent protein （CFP）， Yellow fluorescent protein （YFP）， Red fluorescent protein Protein （RFP）， etc. Fluorescent proteins have good fluorescence stability and high sensitivity， so they are widely used， especially in many fields of biology. In this paper， the basic theory of fluorescent protein， the application status in microbial process engineering， including the application scope， application methods and future development trend will be reviewed， so as to provide some references for more extensive application of fluorescent protein in the future.

Key Words： Fluorescent protein; Microbes; Process engineering; Application research

荧光蛋白最初于1992年自水母体内克隆而来，其荧光特质可以有效地揭示生物分子的运动规律及其基因本质，借助此特性可应用于基因的表达调控、生物分子相互作用、蛋白质中蛋白折叠、蛋白间信号传导以及各种生物蛋白酶活性分析等[1]。目前已经分离出的荧光蛋白分布于整个可见光区，主要有绿色、蓝色、青色、黄色以及红色荧光蛋白[2]。每种荧光蛋白的应用特性各有不同，可应用于目的细胞的筛选、细胞内状态表征等方面。

1  荧光蛋白

荧光蛋白的应用由来已久，其应用属性主要集中在荧光蛋白的亮度、Stokes位移（激发峰与发射峰之间的距离）、光谱特性的优化、新型光转换与光激活荧光蛋白等方面[3]。绿色荧光蛋白是最早分离出的荧光蛋白，在波长300～500nm的激光激发下可发出绿色荧光。其在水母中发现，水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。由于其生色团的形成没有物种特异性，易于引发突变，且对于pH值较为敏感，易形成对应的二聚体，从而拓宽其应用价值[4]。青色荧光蛋白其荧光属性仅次于绿色荧光蛋白。蓝色荧光蛋白分离于野生珊瑚，其荧光量子产率较低，穿透力较弱且容易对细胞产生伤害，应用较少。黄色荧光蛋白相对穿透力较强，可应用于成像方面。红色荧光蛋白可与橙色荧光蛋白配对使用从而实现对于细胞内的双成像，使得两种分子事件可以同步实现。荧光是荧光蛋白最特别的特点，而其中的发色团起着主要的作用。在α-螺旋上的65、66、67位氨基酸——丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸经过环化、脱氢等作用后形成发色团。有意思的是，发色团形成过程是由外周栅栏上的残基催化，底物只需要氧气。这暗示绿色荧光蛋白被广泛用于不同物种的潜力：在不同物种中能独立表达成有功能的蛋白，而不需要额外的因子。

2  荧光蛋白应用于目的细胞筛选

荧光蛋白主要的应用是微生物的筛选。荧光蛋白与荧光素/荧光素酶不同，无需任何辅助因子，只需蓝光照射便能自发光，而且传统荧光因子发光时会产生光毒性，导致细胞死亡，而荧光蛋白毒性较弱，适合标记活体细胞及组织。与目的基因组成融合蛋白或通过IRES或2A与感兴趣的蛋白共表达，可将荧光蛋白定位到特定的细胞器或膜系统中。将荧光蛋白基因连接到目的基因启动子之后，通过测定荧光强度便可对该基因的表达水平进行检测。或者，将荧光蛋白作为标签与主体蛋白融合，可检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，这也是荧光蛋白最成功的应用之一。而在细胞生物学与分子生物学的应用中，绿色萤光蛋白（GFP）基因常用做报告基因（reportergene）。绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物（例如：兔子）上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。通过基因工程技术，绿色萤光蛋白（GFP）基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达。生物育种筛选使用DNA重组以及改组技术已经日渐成熟，通过编辑筛选从而取得具有特定目的的基因，实现一定功能。荧光蛋白基因片段较短，因此在构建表达载体时配错几率小，比传统的方法更加快速有效[5]。

3  荧光蛋白应用于细胞内状态表征

细胞内状态与其蛋白质构象密切相关，明确蛋白质的构象就可以对细胞内的状态有清晰的认识。如部分科学家通过筛选和建立模型，可以有效筛选出错误基因，构建出基因表达路径及对应数据库，从而有效阻止蛋白质错误折叠，让细胞内蛋白质状态正确表达。如红色荧光蛋白其生色团发光较为明显，可以通过对目标蛋白的融合而显示出对应细胞内蛋白的结构是否错误折叠。绿色荧光蛋白对于pH值较为敏感，可以将绿色荧光蛋白植入需观察的细胞内，通过其荧光变化从而监测细胞内的pH变化，为其他研究奠定基础。

4  荧光蛋白应用方法

熒光蛋白的应用日渐广泛，如何正确且高效的选用对应蛋白至关重要。如荧光蛋白与目标蛋白的融合表达受其单体性质影响，若想直接地追踪目标蛋白或是定位目标蛋白，则要求荧光蛋白是单体，不能影响目标蛋白的功能和定位，此时将荧光蛋白的单体性质放在首位。当前体外检测荧光蛋白单体性质的方法有分子筛法、沉降平衡法等，可以通过荧光蛋白分子筛的峰图是否狭窄，单一粗略的判断其是否为单体，而沉降平衡法能够更加准确地确认其聚合性质。荧光蛋白的使用几乎都是在细胞内或组织内，在生理条件下荧光蛋白的聚合性质关系到目的细胞筛选的成功与否。在选择荧光蛋白时，还要考虑目标蛋白定位环境的pH值，再考虑使用相应的荧光蛋白[6]。此外，荧光蛋白在发光之前需要经历转录、翻译、折叠等步骤，其中折叠过程占据了大部分时间，此过程称之为成熟时间。在标记短寿命的目标蛋白时，如果荧光蛋白的成熟时间太长，可能会出现在目标蛋白开始降解时，荧光蛋白还没有发光，导致无法追踪及定位目标蛋白。因此在选择荧光蛋白时，亦需要考虑其成熟时间。

5  讨论与展望

当微生物研究深入至分子学领域时，可以通过改良基因，筛选特定基因等方法优化荧光蛋白的应用。如通过检测植物病原菌内部的基因表达，研究进行抗病基因如何表达，荧光蛋白起表达作用。通过实时显示病原菌与植物的相互作用，从而研究出对应的抗病菌类。目前各类荧光蛋白的研究应用较为深入，根据不同荧光蛋白的特性，其对应的研究领域已基本明了，并取得了一定的成果。但是在活体成像、蛋白间相互作用等研究方面仍有一定的发展空间。而且由于荧光蛋白能稳定在后代遗传，并且能根据启动子特异性地表达，在需要定量或其他实验中慢慢取代了传统的化学染料。更多的荧光蛋白被改造成了不同的新工具，既提供了解决问题的新思路，也可能带来更多有价值的新问题。细胞筛选现处于研究成果多发阶段，荧光蛋白的应用具有深远的发展前景，但同时存在一定的局限性。

参考文献

[1] 杨晓玫，师尚礼，姚拓，等.接种红色荧光蛋白标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长及结瘤能力的影响[J].草原与草坪，2019，39（4）：78-84.

[2] 史志丹，宋培玲，郝丽芬，等.绿色荧光蛋白在植物与病原菌互作研究中的应用[J].北方农业学报，2019，47（6）：68-72.

[3] 刘春，陈晓虹，姜兰，等.鮰爱德华氏菌的红色荧光蛋白标记及其应用[J].江苏农业学报，2019，35（3）：661-666.DOI：10.3969/j.issn.1000-4440.2019.03.022.

[4] NguyenAW，DaughertyPS.EvolutionaryoptimizationoffluorescentproteinsforintracellularFRET.NatBiotechnol，2018（23）：355-360.

[5] 陈彩玲，毛丙永，崔树茂，等.绿色荧光蛋白标记植物乳杆菌及其生物学特性分析[J].食品与发酵工业，2019，45（20）：22-28，34.

[6] 董小娜，陈泽慧，毛林强，等.微生物溶藻进程与机制的三维荧光分析方法[J].环境化学，2018，37（6）：1337-1342.