罗汉果SgARF9基因克隆及其CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

辛佳佳 周琼 裴艳艳 李刚

摘要 [目的]研究SgARF9基因与罗汉果果实发育的关系。[方法]在转录组Unigene序列基础上，对罗汉果SgARF9基因进行克隆，并结合CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建以SgARF9为靶基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。[结果]克隆得到SgARF9基因序列，且成功构建包含SgARF9基因靶点的编辑载体。[结论] 该研究为揭示SgARF9基因的分子生物学功能，明确其在罗汉果果实起始发育中的遗传调控机制提供了基础。

关键词 罗汉果;基因编辑;SgARF9基因;克隆

中图分类号 S188+.1文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）02-0119-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.032

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning of SgARF9Gene of Siraitia grosvenoriiand Construction of CRISPR/Cas9 Gene Editing Vector

XIN Jia-jia，ZHOU Qiong，PEI Yan-yan et al（College of Agriculture，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004）

Abstract [Objective]To study the relationship between SgARF9gene and fruit development of Siraitia grosvenorii.[Method]The SgARF9gene of S.grosvenorii was cloned on the basis of transcriptome Unigene sequences，and the CRISPR/Cas9 gene editing vector which used SgARF9as target gene was constructed by combining with CRISPR/Cas9 gene editing technology.[Result]The sequence of SgARF9gene was cloned，and the gene editing vector which contained targets of SgARF9gene was successfully constructed.[Conclusion]This study laid a foundation for revealing molecular biological function of SgARF9gene and clarifying itsgenetic regulation mechanism during fruit initiatial development of S.grosvenorii.

Key words Siraitia grosvenorii;Gene editing;SgARF9gene;Cloning

罗汉果（Siraitia grosvenorii）是我国特色的药食两用藤本植物，因具有雌雄异株发育生物学特性，必须人工授粉才能保证结实率，存在工作量大、成本高、产量低等问题，严重限制了罗汉果规模化种植与产业化发展，其重要成分甜甙Ⅴ在果囊和果皮中含量较高，种子中含量较少[1]。種子硬度高，难以粉碎，会影响甜甙提取。培育无需人工授粉且果实无籽罗汉果品系具有重要的现实意义。

研究表明，通过生长素类似物2，4-D诱导可获得单性结实果实[2]，但生长素类似物诱导可能存在畸形果、安全隐患等弊端，目前未能得到推广，从基因水平研究单性结实具有稳定遗传、品质优良、无畸形果等优点，是单性结实品种获得的可行性途径[3]。

已有的研究表明，生长素响应因子ARFs基因对植物果实发育过程具有调控作用，番茄SlARF7基因对其果实发育具有调控作用[4]。番茄、拟南芥和茄子中ARF8基因与果实单性结实具有相关性[5-6]，黄瓜CsARF09基因在不同时期果实中有表达[7]。通过对罗汉果SgARF9基因克隆及功能验证，探究其在果实发育中的调控作用，可为研究罗汉果单性结实提供基础。

利用传统的转基因技术实现品种遗传改良，会引入外来基因，风险性未知。而

CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、效率高等优越性[8]。借助新型CRISPR/Cas9基因编辑技术，可对植物自身基因的编辑，从而进行品种遗传改良。利用CRISPR/Cas9技术对番茄SlIAA9基因和SlAGL6基因进行编辑，得知其分别与产生单性结实具有相关性[9-10]。通过对罗汉果SgARF9基因定点编辑，进行基因功能验证，可明确其对罗汉果单性结实过程是否具有调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

于盛花期采取种植于广西大学农学院试验田的罗汉果果实，提取总RNA，反转录得到克隆模板cDNA。载体构建所用pYLCRISPR/Cas9Pubi-B、pYLsgRNA-AtU3b和pYLsgRNA-AtU6-1载体均为华南农业大学刘耀光教授惠赠。

1.2 仪器、试剂

电泳设备（DYY-10C型，北京六一）;PCR仪 （Long Gene，A300 Fast Thermal Cycler）;4 ℃冷冻离心机（卢湘仪，TGL-16 M）;2×Es TaqMasterMix（康为世纪）;TransStart FastPfu DNA Polymerase（全式金）;Trans TaqDNA Polymerase（HiFi）（全式金）;BsaI-HF内切酶（NEB）;T4 DNA连接酶（TaKaRa）。

1.3 引物序列 引物序列如表1所示，其中通用引物来自文献引用 ，SP-L1 为测序引物[11-12]。

1.4 研究方法

1.4.1 SgARF9基因克隆及序列分析。

以罗汉果果实总RNA反转录得到的cDNA为模板，以同科其他物种的ARF9基因序列为参考，设计引物对ARF9-5F/ARF9-5R，扩增SgARF9基因cDNA的5′端序列，并与已有的Unigene片段进行序列拼接，接着设计引物对ARF9HF/ARF9HR，对拼接序列进行扩增验证，基因5′端扩增参考2×Es TaqMasterMix（康为世纪）说明书进行，基因扩增验证参考TransTaqDNA Polymerase（HiFi）（全式金）说明书进行，并利用MEGA7和GENEDOC软件对序列进行比对分析、作图。

1.4.2 CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建。

1.4.2.1 靶点接头的选择。

载体构建过程参考文献[12]略有改动，在SgARF9基因不同区域选择2个合适的靶点序列，分别为ARF9-1：CAGTCCTGATCCTTGCATCC;ARF9-2： TGCTACTGCATCTCATGCCG，并经在线软件RNA Folding Form （http：//mfold.rna.albany.edu/？q=mfold/RNA-Folding-Form2.3）分析，设计靶点正反向接头引物。

1.4.2.2 靶点接头制备及酶切-连接反应。

各取10 μL 的10 μmol/L正反向接头引物，加入到80 μL 0.5× TE溶液中混合均匀，将上述混合液置于PCR仪器中， 90 ℃保温 30 s，25 ℃孵化5 min左右，完成退火。将制备的靶点接头SgARF9-1、SgARF9-2分别与表达盒载体pYLgRNA-AtU3b和pYLgRNA-AtU6-1进行酶切连接，连接产物分别命名为SgARF9-2-AtU6-1-gRNA、SgARF9-1-AtU3b-gRNA。反应体系和程序如下：靶点接头，0.5 μL ;1×BsaI-HF Buffer，9 μL;10 mmol/L ATP，1 μL; 20 ng/μL 的pYLsgRNA-AtU3b或pYLsgRNA-AtU6-1质粒，1 μL;BsaI-HF，0.25 μL;35 U/μL T4连接酶0.5 μL;37 ℃ 5 min，20 ℃ 5min，5个循环[8，12]。连接产物于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.2.3 两轮PCR扩增。

以上述酶切-连接产物作为第一轮巢式PCR扩增的模板，第一个反应利用启动子上游引物UF和靶点反向特异引物ARF9-1R、ARF9-2R扩增;第二个反应利用靶点正向特异引物ARF9-1F、ARF9-2F和sgRNA下游引物gR扩增，两步PCR扩增反应体系如表2所示[8，12]。PCR反应程序：95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s，（Tm-5） ℃ 20 s，72 ℃（时间据片段大小定），30个循环;72 ℃，5 min，4 ℃，∞。

在第二轮扩增中选取2组通用引物对，扩增上述PCR产物片段，扩增产物可以连接到双元表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-B中。以第一轮PCR扩增产物为模板，按照表3所示反应体系，利用通用引物对B1/B2和B2/BL进行PCR扩增：分别以SgARF9-1-AtU3b-gRNA的两步扩增产物混合样为模板，用引物对B1/B2进行第二轮PCR扩增;分别以SgARF9-2-AtU6-1-gRNA的两步扩增产物混合样为模板，用引物对B2/BL进行第二轮PCR扩增[8，12]。PCR反应程序：95 ℃ 2 min;95 ℃20 s，（Tm-5） ℃ 20 s，72 ℃（时间据片段大小定），30个循环;72 ℃ 5 min4 ℃，∞。

1.4.2.4 扩增产物的酶切连接及转化。将上述PCR扩增产物纯化回收，与pYLCRISPR/Cas9Pubi-B表达载体酶切连接，反应体系如下：10×Cut Smart Buffer1.5 μL;10 mmol/L ATP，1.5 μL;pYLCRISPR/Cas9Pubi-B载体质粒60～80 ng/μL，1 μL;第二轮PCR回收表达盒扩增产物（10～15 ng/表达盒）1 μL;BsaI-HF内切酶0.25 μL;T4-DNA连接酶35 U/μL，1 μL;加RNAase-free H2O至15 μL。PCR反应程序：37 ℃ 5 min，10 ℃ 5 min，20 ℃ 5 min，15个循环;37 ℃ 5 min[8，12]。连接产物命名为 SgARF9/9-Atu3/6-sgRNA-CRISPR-B。根据大肠杆菌感受态DH5а（全式金）说明书进行载体转化，并送公司测序确认。

2 结果与分析

2.1 基因克隆

在罗汉果转录组测序基础上，克隆得到SgARF9基因的cDNA序列片段（图1）。对拼接序列扩增验证测序后，在测序结果中选取序列，并进行氨基酸比对分析后得知，罗汉果SgARF9序列与同科其他物种的ARF9序列相似性较高，靶点所在区域对应蛋白序列与其他ARF9序列的比对分析结果如图2所示，并分别在序列相似度较高和较低的区域对应的基因序列中选择2个靶点（图3）。

2.2 靶点接头二级结构 由图4中a、b可知，靶点ARF9-1、ARF9-2与sgRNA均不存在连续6 bp以上的匹配区，可用作打靶位点构建打靶载体。

2.3 巢式PCR扩增

通过两轮PCR扩增，得到特异性扩增产物。扩增结果如图5所示，泳道1、2、3、4为第一轮PCR扩增结果，引物对UF/ARF9-1R、UF/ARF9-2R擴增结果分别为泳道1和4所示，引物对ARF9-1F/gR、ARF9-2F/gR扩增结果分别为泳道2和3所示，泳道5和6分别为第二轮PCR中引物对B1/B2和B2/BL扩增结果。