长链非编码RNA影响胰岛β细胞功能的研究进展

李勋 李强

哈尔滨医科大学附属第二医院内分泌科 150000

糖尿病是一种由多种病因引起的以高血糖为特征的终身代谢性疾病，近几十年来，随着经济发展和生活方式的改变，全球糖尿病疫情呈急剧上升趋势，据国际糖尿病联盟估计，2015年有4.15亿20～79岁的糖尿病患者，有500万人死于糖尿病，预计到2040年，年龄在20～79岁的糖尿病患者将增加到6.42亿。糖尿病的流行、糖尿病所致死亡和糖尿病引起的卫生开支在全球范围内继续上升，对社会、财政和卫生体系产生了重要影响[1]。

1 型、2型糖尿病是两种典型的糖尿病类型，其发病与胰岛β细胞功能密切相关。胰岛β细胞的主要功能是产生、储存和分泌胰岛素。1型糖尿病几乎完全丧失胰岛β细胞功能，2型糖尿病在胰岛素抵抗的背景下表现为胰岛β细胞功能缺乏。研究发现，久患1型糖尿病的患者β细胞质量缺失约90%[2]，久患2型糖尿病的患者β细胞质量缺失约65%[3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的功能性RNA，但不编码蛋白质。Morán等[4]通过转录组分析发现了1 128个人类胰岛细胞基因的高置信度集合，其中55%的基因间lncRNA和40%的反义lncRNA具有胰岛特异性。Ku等[5]通过RNA测序技术在小鼠胰岛中鉴定出1 000多个基因间lncRNA，大部分具有β细胞特异性。其中，lncRNA-XLOC_019089仅在β细胞组织中检测到，并且定位于胰腺和十二指肠同源框1(PDX1)位点的反义位置。Bramswig等[6]使用芯片测序和RNA序列分析进一步发现了12个β细胞特异性和5个α细胞特异性lncRNA转录本。通过对11个健康人胰岛中纯化的β细胞深层RNA测序分析，发现132个lncRNA在β细胞中相对于整个胰岛过度表达，而148个lncRNA在β细胞中相对于非β细胞过度表达[7]。大量β细胞lncRNA的限制性分布表明它们可能起到高度β细胞特异性的作用，如调节表观遗传景观和基因表达模式，从而决定β细胞的特性，进一步参与糖尿病的发生、发展。

1 LncRNA概述

研究发现，基因组的大部分被转录成RNA，但只有1%～2%的人类基因组编码蛋白质[8]。基因序列转录后主要形成由非编码RNA(ncRNA)组成的巨大分子网络，它们在真核生物细胞活动调节中发挥核心作用。ncRNA主要分为短链ncRNA和lncRNA两类[9]。其中，长度大于200 nt的基因序列为lncRNA，lncRNA与mRNA一样，是由RNA聚合酶转录。根据lncRNA与mRNA之间的关系，lncRNA可以分为6类：(1)同义lncRNA：与同一链上另一转录物的一个或多个外显子相重叠。 (2)反义lncRNA：如果与编码基因反义链上的转录物外显子相重叠，则称为反义lncRNA。(3)双向lncRNA：在相同或反向方向与一个或多个外显子重叠，这类lncRNA的表达起始位点与其互补链上相邻编码转录物的表达起始点十分靠近。(4)内含子lncRNA:转录自基因的内含子区域。(5)基因间lncRNA：转录自两个基因之间间隔区的lncRNA。(6)增强子lncRNA：从蛋白质编码基因的增强子区域转录而来[9-10]。

目前对lncRNA的研究结果表明，lncRNA主要通过3种途径在基因调控中发挥强大的调控作用：(1)参与染色质修饰：在细胞核中，lncRNA可以通过募集染色质修饰复合物和转录因子来沉默或增强靶基因表达[11]。(2)参与转录调控：来自增强子或启动子的转录本lncRNA在调节转录过程中起核心作用，包括结合、收录、协调转录激活物或抑制物的支架作用。以正义或反义形式通过多种机制在转录水平控制基因的表达，也是调节转录因子活性的辅助因子，还可调节RNA聚合酶(RNAP)Ⅱ的活性。(3)参与转录后调控：在转录后水平，lncRNA依靠识别互补序列的能力，高效专一地与mRNA相互作用，使lncRNA尤其是反义转录本能参与调节mRNA的剪接、编辑、传输、翻译、降解等过程[12]。

2 LncRNA对胰岛β细胞的调节

2.1 LncRNA与胰岛β细胞分化与成熟 胰岛lncRNA经常出现在胰岛富集基因或胰岛特异基因的近端，这些基因在β细胞功能、发育和转录中发挥作用[4-5]。Morán等[4]发现在β细胞成熟过程中存在阶段特异性的lncRNA激活现象。β细胞选择性高表达12个lncRNA，在人胚胎胰腺前体细胞中均为沉默或低水平表达，但后来在成年成熟胰岛中变得活跃。在已鉴定的12个lncRNA中，有一半在体外分化过程中保持沉默或在极低水平表达，但在体内成熟过程中被激活。表明胰岛lncRNA是β细胞分化和成熟的重要组成部分，提示β细胞特异性lncRNA的异常表达可能会影响糖尿病的病理生理学。Morán等[4]对55个2型糖尿病易感位点的分析发现，9个易感位点包含胰岛lncRNA，其中6个与β细胞功能障碍直接相关。胰岛lncRNA-HI-LNC25可正向调节GLIS家族锌指3(GLIS3)的表达，GLIS3编码一种胰岛转录因子，其基因发生突变可导致单基因糖尿病[4, 13-14]。此外，Akermana等[15]发现，2型糖尿病或糖耐量减低者胰岛中PLUTO和PDX1表达下调。在人胰岛β细胞系Endoc-BH1和小鼠β细胞系MIN6中干扰PLUTO表达，PDX1 mRNA水平均降低。在PLUTO基因敲除后，两个远上游的增强子与PDX1启动子接触减少。LncRNA PLUTO可能通过上调PDX1，进而影响β细胞的发育和分化。

已有报道诱导不同来源的干细胞在体内外分化为胰岛β样细胞，然后移植到糖尿病患者或动物模型中，有助于胰岛功能的恢复。Zou等[16]诱导人脐静脉内皮细胞(HUAECs)定向分化为胰岛β样细胞，发现lncRNA ROR通过与microRNA-145的竞争结合，能有效维持干细胞转录因子Sox2基因的表达，保持HUAECs多能性，并调节定向胰岛β样细胞的分化效率[16]。Arnes等[17]研究发现, lncRNA βlinc1基因敲除后导致邻近的编码基因Nkx2.2表达下调，βlinc1基因在小鼠体内的纯合缺失将导致重要的胰岛转录因子(Nkx2.2、Pax6、Mafb、Pdx1和NeuroD1等)表达下调，导致胚胎发育过程中β细胞功能受损，成年小鼠胰岛发育缺陷和葡萄糖稳态受到破坏。

2.2 LncRNA与胰岛β细胞凋亡及增殖 研究发现,在体内外条件下，下调lncRNA TUG1可增加胰岛β细胞凋亡[18]。免疫组织化学分析显示，小鼠胰岛面积减小，对MIN6细胞的研究显示，敲除lncRNA TUG1基因后，凋亡蛋白酶-3、凋亡蛋白酶-9、凋亡蛋白酶-12表达显著增加，抗凋亡蛋白Bcl2表达显著减少，lncRNA TUG1可能影响线粒体/细胞色素C以及内质网介导的凋亡通路。此外，研究人员还发现，lncRNA Meg3基因敲除后，胰岛素阳性细胞面积减少，β细胞凋亡率增加。Sisino等[19]发现，在原代β细胞和MIN6细胞中沉默lncRNA Lnc03，β细胞增殖被抑制，而过度表达则刺激β细胞增殖，认为Lnc03调节β细胞生长。Ruan等[20]发现在Min6细胞和db/db小鼠中过表达lncRNA p3134，可降低胰岛β细胞凋亡率，部分逆转其对葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)功能的毒性作用，恢复db/db小鼠胰岛素合成和分泌能力，增加胰岛素阳性细胞面积，并且观察到PDX1、纤维肉瘤癌基因同源物(Mafa)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)、2型糖尿病易感基因转录因子7类似物2(TCF7L2)的表达水平都上调，认为lncRNA p3134对维持β细胞功能具有积极作用，对β细胞关键调节因子(PDX-1、Mafa、GLUT2和TCF7L2)具有正向调节作用。进一步研究发现lncRNA p3134可能通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对GSIS具有保护作用。

2.3 LncRNA与胰岛素分泌和胰岛素敏感性 研究发现，一些lncRNAs能够调节胰岛素的分泌和敏感性。Xu等[21]报道lncRNA SRA能提高脂肪细胞的胰岛素敏感性和胰岛素刺激的葡萄糖摄取。机制可能是SRA调节影响胰岛素敏感性的各种因子的表达：SRA在ST2脂肪细胞中的过表达抑制了胰岛素敏感性的负调控因子如细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)-1和SOCS-3的表达，而促进正调控因子如SH3结构域的表达，如含有Sorbs1的SH3结构域。此外，升高的SRA增加胰岛素刺激的葡萄糖摄取，这与胰岛素刺激的Akt和叉头框蛋白O1(FOXO1)磷酸化增加相关；相反，使用慢病毒系统敲除SRA基因导致抑制胰岛素刺激的葡萄糖摄取和胰岛素刺激的Akt和FOXO1磷酸化[21]。

LncRNA TUG1参与调节胰岛素的分泌。Yin等[18]发现在体外和体内条件下，下调lncRNA TUG1可减少胰岛素分泌。在Min-6细胞中敲除lncRNA TUG1基因导致与胰岛素合成/分泌相关的转录因子mRNA水平降低，如PDX1、神经源性分化因子1(NeuroD1)、Mafa和GLUT2。此外，研究还发现，母系表达的小鼠基因3(Meg3)是胰岛β细胞中胰岛素合成和分泌相关的一种新的lncRNA调节因子。Meg3基因敲除通过抑制包括PDX-1和Mafa在内的关键转录因子的表达来减少胰岛素的产生[22]。Wang等[23]研究表明，核内的Meg3能与胰岛细胞中的一种多梳状抑制复合物-2的甲基转移酶EZH2结合，从而介导Rad21、Smc3和sin3α启动子上H3K27的三甲基化，抑制这些转录因子的表达，进而促进MafA的表达，影响胰岛素的产生。LncRNA Gas5是哺乳动物细胞凋亡和生长的关键调节因子，Jin等[24]发现，lncRNA Gas5在正常小鼠胰腺中表达相对较高，在糖尿病小鼠中表达较低，特别是高血糖时lncRNA Gas5水平显著降低。且发现lncRNA Gas5的表达水平受葡萄糖浓度动态调节，高浓度葡萄糖能抑制lncRNA Gas5的表达。体内外干扰lncRNA Gas5之后，胰岛素的生物合成和分泌减少，同时GLUT2、PDX1和Mafa水平均显著降低[24]。

综上所述，lncRNA在调节β细胞特性和功能方面具有很强的相关性，为糖尿病的诊断和治疗提供了一个新的方向。Ruan等[20]发现，糖尿病患者外周血lncRNA p3134水平高于非糖尿病组，并发现其在血清外泌体中增加了4倍。血清lncRNA具有作为生物标志物的特性，且获取容易，可用于诊断糖尿病。

如今调控lncRNA已成为可能，如同蛋白编码基因一样，可以用RNA干扰技术抑制lncRNA在体内的表达水平，如反义寡核苷酸(Asos)和锁定的核酸GapmeRs可以分别用来阻断lncRNA的活性或诱导酶介降解[25-26]。而一些胰岛富集的lncRNA可调节胰岛发育、β细胞转录因子表达，可用于对功能性β细胞进行基因调控。目前，越来越多的lncRNA被发现，但大多数lncRNA作用机制并不明确，还需进一步研究。