运动调节小凹蛋白-1表达改善2型糖尿病小鼠骨髓内皮祖细胞迁移能力

2020-03-02黄燕凤翟露刘玉花马翠韦薇戴霞

中国运动医学杂志 2020年1期

黄燕凤翟露刘玉花马翠韦薇戴霞

1 广西医科大学第一附属医院护理部（南宁530021）

2 广西医科大学第一附属医院老年消化内科

糖尿病可引起血管内皮损伤和功能异常，促进动脉粥样硬化的发生发展，导致冠心病、缺血性脑卒中及下肢动脉闭塞等，是糖尿病患者致死致残的主要原因[1，2]。而这种血管内皮功能障碍的发生与骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）密切相关[3]。EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，当血管内皮发生局部难以修复的损伤后，EPCs可向血管损伤部位迁移至血管内皮，参与血管新生和血管内皮修复[4]。然而，当机体患糖尿病时，EPCs的数量减少、功能受损，不能有效地发挥EPCs内皮修复作用[5，6]。因此，寻求改善糖尿病状态下EPCs功能的方法及其相关机制，对于治疗糖尿病血管病变有重要意义。

目前，不少研究证实有氧运动能提高老年人、冠心病以及慢性心衰患者的EPCs迁移功能，促进损伤内皮的修复[7-9]。但目前关于运动对糖尿病患者或者动物模型的EPCs功能作用研究较少，尚未发现有研究报道有氧运动、抗阻运动以及联合有氧-抗阻运动（联合运动）对糖尿病EPCs迁移能力的影响，且其相关机制尚不十分明确。有研究证实，小凹蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）参与血管修复和生成过程[10，11]，但Cav-1与EPCs关系的研究较少，而高血糖可改变Cav-1 的表达，同时使EPCs 功能受损[12，13]。运动是否能通过调节Cav-1 表达改善糖尿病小鼠EPCs的迁移能力，以及哪种运动的效果更好有待进一步研究。本研究对2型糖尿病小鼠实施为期8周的有氧运动、抗阻运动以及联合运动干预，体外分离培养骨髓源EPCs后比较各组EPCs迁移能力以及Cav-1 蛋白表达情况，探索哪种运动更能改善EPCs 迁移能力以及Cav-1 蛋白表达，从而促进血管内皮修复和血管再生，为运动治疗糖尿病、防治糖尿病血管并发症提供新的基础研究依据和新的思路。

1 对象和方法

1.1 动物及分组

将40 只8 周龄雄性db/db 小鼠（品系：BKS-DB/Nju；血糖28 mmol/L；体重42.27±1.21 g；公司：南京大学-南京生物医药研究院）按照电脑产生的随机数字进行编号，随机分为有氧运动组、抗阻运动组、联合有氧+抗阻运动组（联合运动组）以及对照组，每组10只。

1.2 主要实验试剂

RIPA 裂解液（碧云天）、PMSF溶液（索莱宝）、10X电泳转膜液（索莱宝）、甲醇溶液（成都科龙）、5X Tris-甘氨酸电泳缓冲液（索莱宝）、抗体Cav-1（100 μl）（美国CST 公司）、Western blot 一抗稀释液（索莱宝）、Western blot 二抗稀释液（碧云天）、1×PBS 缓冲液（pH 7.2- 7.4，索莱宝）、蛋白磷酸酶抑制剂混合物（100X，索莱宝）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）、荧光二抗（羊抗兔，美国LICOR 公司）、荧光二抗（羊抗鼠，美国LICOR公司）。

1.3 运动训练

各组均以普通饲料喂养。空白组不进行任何运动干预；各运动组分别采取相应的运动，运动方案参考既往研究并改良[14，15]，由专人负责运动训练干预，每周运动6 天，共8 周。有氧运动组db/db 小鼠在坡度均为0度WDW-1型8跑道小鼠跑台（北京东西仪器科技有限公司，出厂编号：2016020-022）跑步。在第1周时有氧运动速度为10 m/min，逐渐增加至15 m/min，30 min/d，第2～8周速度为15 m/min，60 min/d。抗阻运动组db/db小鼠的尾部缠绕一定重量的水球进行爬梯训练，具体干预方案见表1。联合运动组每周的运动量为有氧运动与抗阻运动各一半的方式，见表2。

表1 抗阻运动组运动方案

表2 联合运动组运动方案

1.4 EPCs的分离培养

于运动干预第8 周后取材，各组分离培养EPCs 方法均一致。颈椎脱臼法处死小鼠，于75%乙醇内浸泡5～10 min，无菌分离小鼠肱骨、股骨及胫骨并离断，以含三抗（青霉素-链霉素-庆大霉素）的无菌PBS 充分冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞至无菌15 ml 离心管中，将骨髓腔冲洗液轻柔吹打均匀后，按1︰1 体积缓慢滴加于淋巴细胞分离液上，2000 rpm/min 离心 20 min 后用巴氏吸管吸取出中间白色云雾状细胞层，加入PBS 清洗细胞去除残留的淋巴细胞分离液，离心获取细胞沉淀，加入EGM-2MV 培养基重悬细胞。将细胞培养物接种于包被了纤维黏连蛋白（FN 蛋白）的T25 细胞培养瓶中，于二氧化碳培养箱中培养。此后，每天观察细胞生长情况，每3天换液一次，去除非贴壁细胞。细胞扩增至一定数量后进行EPCs的鉴定，待细胞汇合度达到80%后开始进行细胞传代培养。

1.5 EPCs的鉴定

向各组的24孔板中依次加入DiI 标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-ac-LDL，Molecular Probes 公司）和带FITC 荧光标记的豌豆凝集素（FITC-UEA-I，Sigma 公司），共聚焦显微镜观察到Dil-acLDL、FITC-UEA-I双染色阳性的细胞被认为是正在分化的EPCs[16]。流式细胞检测CD133 表型，Anti-mouseIgG-Fc/PE（博奥森）作为同型对照（阴性对照），将PE荧光标记的造血干细胞抗原CD133 抗体（博奥森）加入待测细胞溶液中孵育30 min。PBS 溶液洗涤后，以300 g/min 转速离心5 min，重悬调整细胞密度后，流式细胞仪检测CD133 表型表达情况。

1.6 EPCs的迁移功能检测

采用细胞划痕实验反映细胞迁移功能。1～3×106个EPCs 接种于6 孔板，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h。用200 μL 移液器配合直尺枪头垂直于6 孔板，对照预先画好的线，均匀画条痕。用1×PBS缓冲液洗涤6 孔板3 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基继续置37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。各组EPCs分别于0 h、48 h在倒置荧光/相差显微镜成像分析系统定点拍照并分析，绘制柱状图[17，18]。

1.7 蛋白免疫印迹技术（Western blotting）

往25 cm2细胞培养瓶里加PIRA裂解液、苯甲基磺酰氟溶液（PMSF）、蛋白磷酸酶抑制剂混合液以裂解EPCs，裂解后进行4℃、14000 r/min 的条件离心15 min，吸取上清液，5×蛋白上样缓冲液按照1︰5体积比加入上清液，混匀后槽式加热器调节温度100℃，加热10 min 使蛋白变性。使用BCA 法测定蛋白浓度，将蛋白进行10%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转到聚偏二氟乙烯膜上（PVDF）。制备蛋白凝胶后，电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭至少1 h，之后用TBST 洗涤。一抗孵育2 h 后二抗孵育1 h，TBST 洗涤，最后用Odyssey 双色红外激光成像系统扫描，选择800 通道，调节明亮度，记录各组蛋白灰度值。

1.8 统计学分析

采用Image J 软件分析图片，SPSS 22.0 统计软件对数据进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，检验水准为α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

骨髓分离后获得的细胞在FN 蛋白包被的培养瓶中培养，24 h 开始贴壁，4 d 贴壁基本完全，可见较多贴壁细胞，呈圆形、短梭形，部分为长梭形；随着培养时间的延长，圆形细胞数量减少，梭形细胞数量渐渐增多，可出现细胞集落，7 d 后EPCs 大量增殖，并有梭形贴壁细胞在其边缘不断生成，可出现“铺路石”样改变，见图1。

图1 倒置显微镜下EPCs的形态（×100）

2.2 双荧光染色鉴定

在激光共聚焦显微镜下，胞浆摄取DiI-ac-LDL，显示红色，胞膜结合FITC-UEA-I，显示绿色，双染色阳性细胞为黄色，为正在分化的EPCs。各组EPCs 的DiIac-LDL 及FITC-UEA-I 双染阳性率为73.50%±7.47%（图2）。流式细胞仪检测表型CD133 检出率为63.29%（图3）。

图2 DiI-ac-LDL及FITC-UEA-I双染试验结果（×200）

2.3 EPCs迁移能力检测

本研究观察了运动8 周后EPCs 的迁移能力，与对照组相比，运动可以改善EPCs 的迁移能力。8 周运动结果显示：与对照组相比，有氧运动、抗阻运动以及联合运动均能明显改善EPCs 的迁移能力（P＜0.05），且联合运动较有氧运动、抗阻运动效果更佳（P＜0.05）。见图4。

图3 流式细胞仪检测CD133表型

图4 各组EPCs在干预8周后的迁移功能比较

2.4 各组Cav-1蛋白表达的比较

经过8 周的运动干预，我们采用Western blotting法检测糖尿病小鼠EPCs的Cav-1蛋白表达水平。检测结果显示，与对照组、有氧运动组和抗阻运动组相比，联合运动组Cav-1 蛋白表达水平升高（P＜0.05）。有氧运动组、抗阻运动组与对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 各组EPCs在运动干预8周后Cav-1表达水平的比较

3 讨论

研究表明，当血管内皮受损时，EPCs 可以从骨髓动员、迁移，整合到血管网络，通过分化为成熟的内皮细胞从而修复损伤血管和生成新的血管[4，5]。而2型糖尿病会导致EPCs的迁移能力下降，影响其趋化至受损内皮进行黏附、侵袭，从而使其修复内皮的功能减弱[19]。不少研究报道称有氧运动或耐力训练能改善中老年人EPCs 的迁移能力[7，20]，然而在病理状态下，不同的运动方式对EPCs的影响效果可能不同。目前，不同运动方式对2 型糖尿病患者EPCs 功能的作用尚未十分明确，相关机制也尚不清楚。本实验对糖尿病db/db 小鼠进行8周的运动训练，有氧、抗阻及联合运动三种运动方式组均呈现出较对照组更强的骨髓EPCs 体外迁移能力，提示规律的运动可提高EPCs 的迁移能力，促进EPCs 的血管内皮修复功能，与夏文豪等[20]的研究结果一致。本研究还发现，三种运动呈现出不同的促进作用效果，其中以联合运动组的运动效果最佳，其增强EPCs迁移能力的效果较单纯的有氧、抗阻运动有显著差异。本研究认为需进一步探究联合运动对2型糖尿病患者骨髓EPCs 影响的作用机制，为2 型糖尿病患者或相关血管疾病的预防、诊断与治疗以及疾病的延缓提供更好的资料。

为了探索运动改善EPCs 功能活性的可能分子机制，我们对各组糖尿病小鼠EPCs 中与内皮修复相关的Cav-1 蛋白表达量进行检测。Cav-1 是小凹蛋白家族成员之一，在内皮细胞中含量丰富[21]。血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor recep⁃tor 2，VEGFR-2）定位于Cav-1 中，Cav-1 可通过正性或负性调控VEGFR-2 从而调节血管内皮生长因子（VEGF）的信号通路，参与EPCs的内皮损伤修复过程[22]。有研究报道，雌激素能促进EPCs 的增殖，与雌激素调控Cav-1的表达有关[23]。本研究结果显示，经过联合运动训练后Cav-1 蛋白的表达明显提高，并改善了EPCs迁移能力，提示联合运动可能通过上调Cav-1 蛋白的表达改善EPCs 的迁移能力。已有研究报道，Cav-1 缺失后，EPCs 从骨髓到外周的动员减少[24]。Wunderlich等[25]通过对Cav-1表达缺陷小鼠的研究发现，Cav-1基因的表达缺陷可导致其心血管系统出现明显的异常。Rodriguez-Feo等[26]研究发现，粥样斑块处Cav-1蛋白表达水平降低，且其低表达与不稳定斑块的形成密切相关。以上多个研究与本研究结果均表明，血管内皮的稳定修复不能缺少Cav-1。然而，也有研究表明，糖尿病状态下血管功能失调，可能与高糖所致的Cav-1 表达增高有关[27]。可见，Cav-1的表达水平高低影响着血管内皮的修复。而本研究结果显示，联合运动组明显上调EPCs 的Cav-1 蛋白表达水平，提示Cav-1 可能参与联合运动相关EPCs功能活性的改善，且其表达水平对EPCs迁移功能有促进作用；亦表明联合运动方式较单纯有氧或抗阻运动方式更能提高Cav-1蛋白表达水平，从而更好地改善EPCs功能，修复内皮损伤。