苦参碱诱导H466肺癌细胞凋亡及对Wnt信号通路的影响

崔胜男 邢秀菊

肺癌是一种恶性肿瘤，长时间吸烟及不良的饮食习惯会导致肺癌的形成，根据大数据显示：全球肺癌患者的死亡率超过160万人，并逐年递增[1-2]。我国肺癌患者无论是疾病新增率还是死亡率多高于世界水平。肺癌患者早期时很难被发现,无明显特异性,所以在确诊时已处于中晚期[3]。目前手术及放化疗是肺癌患者临床治疗方法之一，但放化疗过程中带给患者强烈的刺激作用，患者出现心理和身体上的不适，产生排斥情绪，治疗效果受到影响[4]。

苦参碱(matine)是从豆科植物提取的生物碱类，苦参是其中主要成分之一，在抑制炎症、抵抗病毒方面具有重要作用。几年来在广谱抗肿瘤的作用中备受关注[5]。最近研究发现在培养的肝癌及白血病小鼠体内具有明显的抗癌作用,并且无化学药物的不良作用[6]。Wnt通路表达异常发生在多种肿瘤疾病当中，肺癌是其中一种。大量数据表明，在肺癌细胞中观察到APC蛋白及β连环蛋白发生改变是通过Wnt激活，完成传到作用，但是具体的作用机制还不能完全清楚，通过阻断Wnt信号的激活是否能够作为治疗恶性肿瘤疾病的治疗策略还有待考察[7-8]。所以本文通过探讨苦参碱对肺癌H466细胞凋亡有何影响及苦参碱是否能够抑制Wnt信号通路传到，做出研究分析。

资料与方法

一、材料、试剂和仪器

肺癌H466细胞株(上海慧颖生物), 苦参碱( matrine) (上海源叶生物科)；Wnt-2(上海语燕生物科技)，鼠抗人β-catenin(上海麦仓科技), RPMI1640培养基(上海邦景),流式细胞仪(美国/BD， Accuri C6)。

二、细胞培养

将肺癌H466细胞放入RPMI 1640培养液中，常温5%CO2，培养24h后，按照不同的细胞生长情况进行定期传代。

三、分组

按照每孔1×110个细胞数量均匀铺于96孔板内,24h过夜,细胞的融合度达到70%时,此时,把体积为4μl脂质体和体积为200μl缓冲液依次加入到无菌的EP管中,加入不同浓度的苦参碱。对照组为不加入苦参碱 ，低处理组加入0．5 g/L苦参碱。高处理组为2．0g /L苦参碱。

四、MTT法

三组细胞分别培养24 h、48 h、72 h。放入20μLMTT(5 mg/mL)，4h培养后，去上清，加入100μL的DMSO，采用自动荧光酶检测吸光度值(A)抑制率%=(实验组A/对照组A)100%。

五、Hoechst33342-PI荧光双染法

将三组细胞分别在盖玻片的培养基内培养，加入处理因素培养36h，在培养基内加入少量Hoechst33342溶解溶液，浓度为10μL，37℃ 反应15min。利用4%甲醛笃定细胞10min，在载玻片上滴入少量甘油，荧光显微镜下观察。

六、流式细胞仪检测肺癌细胞周期

三组H466细胞以2×110个/mL浓度置于96孔板，培养24h，4℃放置24h，离心15min，PBS洗涤5min，重复3次，加入70%乙醇l mL，再加入100μLRNA酶,用流式细胞仪分析三组细胞周期，分为G0/G1、S、G2/M期。

七、Western blot检测

在6孔板中加入100μg的胰蛋白酶提取液,将细胞提取液放入EP管中,并与胰蛋白酶提取液按照1 ∶100进行混合,再放入冰箱中冷冻10分钟。使细胞完全裂变,成为E溶液;在EP管中放入H466细胞，并按照1 ∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 mL,使细胞完全裂变,成为F溶液;再把E和F溶液以80 ∶1的体积进行摇匀,配制成工作液,放入37.5度的保温箱中20分钟,冷却后计算Wnt蛋白质的浓度。

八、qRT-PCR检测β-cateninmRNA

在H466细胞培养液中加入氯仿，摇荡，离心，使溶液呈乳白状，离心15min，加异丙醇，加75%乙醇离心，干燥，-80℃保存。反转录体系：94℃15min，94℃15s，60℃34s，72℃10min，重复40次反转录体系，最后计算(见表1)。

九、统计学处理

结 果

一、MTT检测苦参碱对H466细胞活性的影响

MTT实验证明，低处理组的肺癌H466细胞活性低于无苦参碱的对照组(P<0.05)，高处理组的肺癌H466细胞活性低于低处理组，说明苦参碱对肺癌H466细胞具有抗肿瘤活性的作用(P<0.05)(见图1)。

二、肺癌H466细胞的凋亡情况

对照组为正常的肺癌H466细胞呈蓝色荧光表达的活细胞，低处理组发现H466细胞呈现早期凋亡并细胞核破碎形成凋亡小体凋亡程度高于对照组(P<0.05)，高处理组呈现红色荧光的死细胞细胞凋亡率高于低处理组(P<0.05)(见图2，3)。

*表示于对照组P<0.05;#表示于低处理组P<0.05

三、检测H466细胞凋亡周期及凋亡率

H466细胞在苦参碱作用下，在G0/G1期细胞凋亡比例升高，S期下降，对照组于低处理组差异较小(P>0.05)，高处理组与低处理组、对照组有差异(P<0.05)，但在G2/M无明显改变，G0/G1在高处理组凋亡率呈现增高的趋势(见表2)。

四、Wnt信号通路蛋白表达

免疫印迹结果：低处理组中的Wnt-2蛋白表达低于对照组(P<0.05)，与低处理组相比高处理组细胞中Wnt-2中表达最低(P<0.05)(见图4，5)。

*表示与对照组P<0.05；#表示与低处理组P<0.05

*表示于对照组P<0.05;#表示于低处理组P<0.05

五、qRT-PCR检测β-cateninmRNA

qRT-PCR显示：低处理组细胞中β-catenin mRNA表达低于对照组，在高处理组细胞中β-catenin mRNA表达少于低处理组(见图6，7)。

M表示Maker，1表示对照组；2表示低处理组；3表示高处理组。

*表示于对照组P<0.05;#表示于低处理组P<0.05

讨 论

放化疗治疗肺癌患者产生的不良反应较大，延长治疗周期，对身体的伤害较为严重。中药治疗肺癌毒副作用少，优势较为突出[9]。目前，关于苦参碱抗肿瘤的研究较多，在对肝癌中，发现苦参碱能够促进肝癌细胞的凋亡，并随着药物的作用时间及浓度增强，肝癌细胞的合成能力逐渐下降[10]，但是苦参碱对肺癌H466细胞有何作用，文献尚少，本文通过苦参碱对肺癌H466的抑制作用及Wnt研究结果如下。

目前抗肿瘤的药物对肺癌H466细胞的抑制方式有很多，促进癌细胞凋亡、分化和死亡。本文通过MTT检测发现苦参碱可以抑制肺癌H466细胞活性，浓度由小到大，肺癌细胞出现凋亡及大面积死亡。说明苦参碱诱导肺癌细胞凋亡而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。张小文[11]研究发现当苦参碱浓度分别为0.5g、1.0g及2.0g时，细胞凋亡的程度不断增加，这说明苦参碱的诱导凋亡作用有浓度依赖性。其中的诱导凋亡机制与卓新凤[12]研究结果一致。本文研究表明正常肺癌H466细胞在免疫双荧光中表现蓝色，低处理组肺癌细胞出现凋亡并形成凋亡小体，高处理组出现大量肺癌细胞死亡，呈现荧红色。卢迎宏[13]在体外增殖的肺癌A549细胞中加入苦参碱，肺癌细胞出自噬现象。Pu J[14]发现在肺癌细胞内加入2.0g苦参碱，肺癌停止分化出现分解。这与Chen SF[15]研究结果一致。通过流式细胞发现肺癌细胞在G0/G1周期时凋亡增对，并随着苦参碱浓度升高而凋亡不断增加。庞琪[16]研究发现苦参碱对非小细胞肺癌能有减少增殖，并呈现浓度和时间的依赖性，在G0/G1细胞凋亡发现苦参碱明显增加肺癌细胞的凋亡数量。这与惠朋利[17]研究结果一致。

近些年来，Wnt信号通路在众多肿瘤中被发现，例如在胃癌和子宫内膜癌中的异常变化具有重要参考价值。Wnt信号被激活时，靶器官的分化受到限制，干细胞特异性被保留，会加快肺癌细胞的分化，导致肿瘤形成。本文研究发现Wnt信号通路在肺癌H466细胞中活性较高，并随着苦参碱浓度的增加而活性降低。方彪彪[18]发现苦参碱抑制异常Wnt信号通路表达，能够诱导肺癌细胞凋亡，并随着浓度的增加而凋亡增多。可能是苦参碱干预后肺癌H466细胞产生分化成熟，Wnt信号通路减少表达，使肺癌H466细胞进行成熟阶段，Wnt信号通路会加快肺癌H466细胞的繁殖，这与An Q[19]研究结果一致。本文研究发现β-cateninmRNA在正常肺癌细胞内活性升高，但是苦参碱增加会减少其表达，说明苦参碱抑制β-catenin活性。陆周一[20]研究表明苦参碱阻断肺癌细胞增殖，诱导凋亡，可能与苦参碱抑制β-catenin活性有关，而达到改善肺癌病情的目的。

综上所述：苦参碱可以加快肺癌H466细胞凋亡，在这过程中可能与阻断Wnt信号通路传达有关，苦参碱可以阻断Wnt信号表达，抑制肺癌细胞分化。