冬凌草有效成分的提取方法及含量测定方法研究进展

张婉晴，涂祖月

冬凌草有效成分的提取方法及含量测定方法研究进展

张婉晴，涂祖月

（信阳职业技术学院， 河南 信阳 464000）

冬凌草是一种具有多种生物活性的药材，常用的提取方法有溶剂浸提法，水蒸气蒸馏法，超临界CO2萃取法。目前，人们采用紫外分光光度法、高效液相色谱法等技术，对冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、熊果酸、齐墩果酸和猫眼草黄素等有效成分的含量进行测定。对近年来冬凌草的提取方法及有效成分的含量测定进行了综述和研究，为更好地开发和利用冬凌草提供理论依据。

冬凌草； 提取方法； 含量测定方法； 研究进展

冬凌草，为唇形科香茶菜属植物碎米桠(Hemsl.)Hara的干燥地上部分。现代研究表明：冬凌草中含有萜类、甾体、生物碱类、黄酮、挥发油、内酯、皂苷等化学成分；药理实验表明冬凌草具有清热、解毒、消炎等作用，如冬凌草醇剂对金葡菌、甲型溶链菌有明显的抑制作用以及抗炎、免疫增强作用；冬凌草对治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、蛇虫咬伤等具有很好的作用，此外具有较好的抗癌、抗肿瘤活性，对食管癌、贲门癌有很好的疗效，且毒性较低[1]。冬凌草作为一种活性良好、毒性低的药物受到众多学者关注，人们采用各种提取技术及含量测定方法不断对其进行深入研究。为更好发挥冬凌草作用，现就近年来一些研究方法进行总结。

1 冬凌草的化学成分

研究发现[1]，冬凌草药材中化学成分主要有：冬凌草甲素、冬凌草乙素、卢氏冬凌草甲素、贵州冬凌草素等二萜类，冬凌草碱、7-羟基-4-(1H)-喹啉酮、黄嘌呤等生物碱类， 5-羟基-3'、4'、7-三甲氧基黄酮，苜蓿素，胡麻素等黄酮类，α-香树脂醇、熊果酸、齐墩果酸等甾体类，棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯、β-蒎烯等挥发油类，香草酸、阿魏酸等有机酸类，以及葡萄糖、α-D-呋喃果糖等糖类。另外冬凌草中含有17中氨基酸，人体必需的8种氨基酸除了色氨酸外，其余都含有并且含量较高。

2 冬凌草的提取方法

2.1 传统提取方法

所用溶剂包括水和有机溶剂，如不同体积分数的乙醇，体积分数为70%的丙酮，体积分数为95%的甲醇。目前对冬凌草的浸提方法有浸渍法、渗漉法、回流法、水蒸气蒸馏法等。

2.1.1 浸渍法

宋发军[2]等用体积分数为95%的乙醇冷浸提取冬凌草粉末，浓缩后将乙醇提取物溶于水，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得粗提物。

荆绮[3]等采用HPLC法测定冬凌草甲素的含量，考察不同浓度乙醇对冬凌草甲素提取率的影响，在此基础上选取乙醇用量、冷浸时间、提取次数和药材规格4因素，得最佳提取工艺：冬凌草粉碎成细粉（全部过5号筛，能通过6号筛的粉末占98%），加入15倍量体积分数为95%的乙醇，冷浸提取2次，每次4 d。

2.1.2 渗漉法

俞莉[4]等以冬凌草甲素的含量为考察指标，采用正交试实验法研究冬凌草的渗漉提取工艺；结果优选出渗漉提取的最佳工艺为：采用体积分数为95%的乙醇浸泡12 h后，以每千克药材每分钟3 mL流速渗漉，收集10倍量渗漉液。

2.1.3 水蒸气蒸馏法

唐倩囡[5]等取粉碎好的冬凌草，用正己烷萃取2次后，浓缩萃取液并把浓缩后的油状物置于挥发油提取器中，加水，加热提取12 h得到淡黄色的油状液体，经无水硫酸钠干燥，过滤，得挥发油待测品。

2.1.4 回流提取法

卢海英[6]等用体积分数85%乙醇回流提取，浓缩并静置过夜，得上清液。下层沉淀再用体积分数50%乙醇热提，冷却静置抽滤得上清液，合并上清液并浓缩，再经石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，得冬凌草各萃取部分粗提取物。

杨元风[7]等用体积分数95%甲醇回流提取冬凌草粉碎物，浓缩后加甲醇至含醇体积分数90%，用适量活性炭回流脱色，过滤得提取液，最后浓缩得粗提物。

刘建群[8]等取粉碎后的冬凌草，用8倍体积分数95%乙醇在室温下浸泡12 h，回流提取3次每次1.5 h，合并提取液，浓缩得总浸膏。总浸膏用水分散呈混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩得各萃取部分。

2.2 现代提取方法

新方法新技术不断涌现并被应用于冬凌草有效成分的提取之中，如超临界流体萃取技术、超声提取技术、组织破碎提取、顶空固相微萃取等。

2.2.1 超临界流体萃取法

将临界状态下的流体如CO2，以一定温度下通入提取器中，可溶组分溶解在超临界流体中，并且随同该流体一起经过减压阀降压后进入分离器，溶质从气体中分离出来。

陈莹[9]等以冬凌草甲素的提取率为指标，通过正交试验考察冬凌草甲素的超临界CO2萃取工艺，结果：压力35 MPa，温度328.15 K，夹带剂流量4 mL·min-1, CO2流量25 g·min-1，以HPLC法对萃取物定量分析，得冬凌草甲素提取率为0.402%。

张彦焘[10]等将 14.0 kg 干燥冬凌草粉碎，过 20 目（830 μm）筛，以料液比 1∶1.5 的配比加入夹带剂（90%乙醇水）21.0 L，充分混匀。然后采用SPE24×2-(32) 超临界萃取装置进行 CO2萃取，提取条件：压力 30 MPa，提取温度 50 ℃，提取时间为3 h。 50 ℃下减压浓缩提取液，得到粗浸膏445.16 g。从冬凌草中分离得到1个黄烷类化合物，命名为冬凌烷 A。

2.2.2 超声波萃取

是在水浸提的同时加超声波辅助法，不仅能缩短提取时间，提高效率，同时避免高温对有效成分的影响。

李菲[11]等采用HPLC 法测定冬凌草甲素含量，Box-Be-hnken 设计考察超声时间、超声温度和液料比对提取率的影响，硅胶柱层析结合重结晶法进行纯化。结果最佳条件为超声时间30 min，超声温度 50 ℃，液料比25∶1，提取率为4.79 mg·g-1。石油醚-丙酮梯度洗脱结合重结晶法可得到体积分数99.17% 的冬凌草甲素。

汪伦记[12]等对超声辅助乙醇回流提取冬凌草抑菌活性成分的工艺进行研究，以金黄色葡萄球菌为供试菌，考察了乙醇体积分数、超声功率、提取温度、料液比和提取时间对冬凌草抑菌活性物质提取的影响，得最优提取工艺条件为：乙醇体积分数为95%、超声功率200 W、提取温度62 ℃、提取时间44 min、料液比1∶25 g·mL-1。

2.2.3 水蒸气蒸馏法

组织破碎提取法是通过闪式提取器来实现的，适用于植物软、硬材料组织。基本原理是在室温和适当溶剂存在下，将物料在数秒钟内破碎至细微颗粒，通过高速搅拌、振动、负压渗滤 3 种因素的最佳结合，使有效成分迅速达到药材组织内外平衡，通过滤过达到提取目的。在鞣质、黄酮类、皂苷类等成分的提取等方面均取得了较大进展[13]。

冯卫生[14]等用体积分数70%丙酮水溶液组织破碎提取冬凌草地上部分，提取液用相当于提取物10%的活性炭脱色，滤液浓缩后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得各部位萃取物。

2.2.4 顶空固相微萃取（HS-SPME）法

顶空固相微萃取是固相微萃取的一种，可用于挥发性风味物质的提取，常与高效液相色谱、气相色谱和气相色谱-质谱联用多种分析技术联用。

李高申[15]采用顶空固相微萃法提取冬凌草中的挥发性成分，即萃取样品温度85 ℃，时间30 min，在250 ℃下脱附1 min；然后用气相色谱-质谱联用法测成分及计算各成分相对含量。

3 含量测定方法

已报道的冬凌草有效成分含量测定方法较单一。可钰[16]等采用紫外分光光度法测定冬凌草提取物中总二萜的含量，即238 nm处测定吸光度；还有学者用高效液相色谱法，对冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、熊果酸、齐墩果酸、猫眼草黄素等6种有效成分的含量测定，具体方法如下。

邹盛勤[17]等建立反高效液相色谱法（RP-HPLC）测定冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量，方法是色谱柱为C18RP柱（250 mm×46 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（87∶13）；流速0.8 mL·min-1，光电二极管阵列检测器，检测波长210 nm，柱温25 ℃。

张静[18]等采用Waters UPLC色谱系统，ACQUITY BEH Shield PR18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为体积分数0.1%甲酸甲醇溶液（A）-体积分数0.1%甲酸甲醇溶液（B），梯度洗脱（0~9 min，体积分数70%A→体积分数57%A；9~10 min，体积分数57%A→体积分数48%A；10~11 min，体积分数48%A→体积分数48%A；11~14 min，体积分数48%A→体积分数14%A；14~22 min，体积分数14%A→体积分数14%A），流速0.2 mL·min-1；检测波长为250 nm和210 nm；柱温23 ℃。可在22 min内完成冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、齐墩果酸和熊果酸，5个成分的色谱分析，且各成分色谱峰之间具有良好的分离度。

赵新燕[19]等对冬凌草采用体积分数95%乙醇热浸取法保温回流30 min，过滤，提取液经浓缩得到粗品，粗提浸膏经反相色谱分离纯化，分离条件为：色谱柱（ID63×700 mm, Diamonsil C18, 粒径25~40 μm），流动相：甲醇-水（55∶45），流速：35mL∶min-1, 检测波长239 nm，进样体积5 mL，将搜集到的洗脱液蒸发浓缩干燥，得冬凌草甲素粉末。120 g冬凌草可提取370 mg冬凌草甲素，可供工业化生产工艺参考。

袁兴利[20]等建立同时测定冬凌草药材中迷迭香酸、冬凌草甲素和猫眼草黄素含量的高效液相色谱方法。采用 Ultimate C18色谱柱( 4.6 mm×250 mm，5 μm) ; 流动相甲醇体积分数0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱；流速 1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长338、242 nm。

4 结束语

冬凌草具有较强生物活性且有效成分种类繁多，人们对冬凌草提取方法和含量测定的研究还在不断深入。在对冬凌草化学成分分析和药理作用等研究中，多采用传统的浸渍法提取，该法虽然耗时长，提取不完全，但浸膏提取率大。组织破碎提取法由于破碎后过滤难，提取容器受限等原因，多用于实验室之中[16]；超临界CO2萃取法、顶空固相微萃取法等新技术能加速中药材有效成分的溶出，同时操作简便，但萃取成分主要为挥发性化合物，较单一。冬凌草的含量测定方法较少，文献报道有紫外分光光度法和高效液相色谱法，且主要测定冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、熊果酸、齐墩果酸、猫眼草黄素等6种有效成分上，其他成分的含量测定还未见报道，仍需进一步的研究。

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Research Progress of Extraction Method and Assay Method of Effective Components From()

,

（Xingyang Vocational and Technical College, Xingyang Henan 464000, China）

(Hemsl.)is a Chinese herbal medicine with wide biological activities.Its extraction methods include alcohol extraction method, ultrasound extraction method, steam distillation, supercritical CO2extraction. So far, new technologies (such as UV spectrophotometry, high-performance liquid chromatography and so on) are always used to determine effective constituents including oridonin, ponicidin, rosmarinic acid, olesnolic, ursolic acid. In this paper,the extraction methods and assay methods of effective components from(Hemsl.)in recent years wereintroduced, in order to provide theoretical foundation for better development and use of the plant.

;; Assay method; Research progress

2020-08-20

张婉晴（1986-），女，河南省驻马店市人，助教，硕士学位， 2013年毕业于河南中医学院中药学专业，研究方向：中药规范化种植及质量标准研究。

O657

A

1004-0935（2020）09-1182-04