淫羊藿苷联合骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤区域炎症反应的影响*

秦丰伟, 焦锋, 张兆飞, 黄荷, 唐望

广州市中西医结合医院(广州中医药大学附属广州中西医结合医院)骨三科(广东广州 510800)

脊髓损伤(spinal cord injury)发生率高、治疗困难，已经成为世界性医疗难题。干细胞移植治疗脊髓损伤是目前临床上最有效的方法之一。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)自我更新能力强，具有促进组织修复、抗炎、免疫抑制及神经保护等作用，广泛应用于组织损伤的治疗[1-3]。早期单纯BMSCs移植治疗脊髓损伤有致瘤的风险。现代医学研究发现BMSCs特性与“肾主骨”存在相关性，骨生髓，髓养骨，肾气充足与否可以影响BMSCs功能的发挥。我们的前期试验已证实了补肾中药单体淫羊藿苷(Icariin,ICA)能促进BMSCs的增殖和迁移能力[4]，2018年6月至2019年7月，本研究尝试通过补肾中药单体ICA影响干细胞的生物学特性，以此来减轻脊髓损伤后的炎症反应，为补肾中药联合干细胞技术治疗脊髓损伤提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 1月龄清洁级雄性SD大鼠5只，用于提取BMSCs。2月龄清洁级雄性SD大鼠40只，体重(245±14)g，均由广州中医药大学动物实验中心提供。

1.1.2 主要试剂及实验器材 鼠BMSCs专用培养基(Cyagen公司，RBXMX-90011)、ICA(Sigma公司，I1286)、含0.25%EDTA的胰酶(Cyagen公司，TEDTA-10001-100)、戊巴比妥钠(美国Gibco公司，69020100)等。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs培养及细胞活性检测 按照前期实验的方法提取鼠BMSCs培养至第3代细胞，并进行细胞活性检测[4]。取第三代BMSCs，以5×103的密度接种于96孔板，共6块，每块板6个组，各有5个复孔，置入37℃、5%CO2培养箱中培养，12 h细胞贴壁后，加入不同浓度的ICA进行干预，分为0、0.01、0.1、1.0、10、100 μmol/L ICA组，各组分别干预12、24、36、48、72、96 h后，每孔加入10 μL CCK-8，置于培养箱中继续孵育40 min，于酶标仪波长450 nm处检测各组细胞吸光度值。

1.2.2 实验动物分组 将剩余40只鼠随机分为空白组、模型组、BMSCs组、BMSCs+ICA组，各10只。

1.2.3 脊髓损伤模型的建立 参照文献采用Allen′s打击法，选用致伤能量5 g×10 cm(5 g重物从10 cm高度自由落下)建立鼠脊髓损伤模型[5]。空白组鼠仅暴露硬脊膜，不损伤脊髓。

1.2.4 干细胞移植及标本的收集 建立脊髓损伤小鼠模型，术后静息30 min，通过静脉注射移植干细胞。BMSCs组：常规细胞消化、离心得混悬液，调整细胞最终浓度为5×104·mL-1，取0.2 mL尾静脉注射；BMSCs+ICA组：ICA与BMSCs共育液，细胞最终浓度为5×104·mL-1，取0.2 mL尾静脉注射。对照组和模型组注射等量培养液。

1.2.5 观测指标及测定 在移植后48 h，取脊髓组织提取蛋白，采用液相芯片技术定量分析肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-4(IL-4)的含量，具体步骤按R&D Systems公司提供的检测试剂盒说明进行操作。

2 结果

2.1 ICA对BMSCs活性的影响 实验发现，0.01、0.1、1.0、10 μmol/L剂量的ICA都可以提高BMSCs的活性，最佳作用时间都是48 h，其中1 μmol/L的ICA可以更加明显地提高BMSCs活性，组间差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。但是当ICA剂量达到100 μmol/L时，可以抑制BMSCs活性。

图1 不同浓度的ICA干预不同时间对BMSCs细胞生物活性的影响

2.2 治疗前后TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-10、IL-4水平变化情况 研究结果发现，治疗后与模型组相比，BMSCs和BMSCs+ICA组TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6均下降，而IL-10、IL-4升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且BMSCs+ICA组改善幅度明显优于BMSCs组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

项目空白组模型组BMSCs组BMSCs+ICA组TNF-α 治疗前302.6±30.15789.2±45.75759.0±43.05771.4±47.25 治疗后304.2±26.10776.8±45.90205.2±12.85∗146.8±16.90∗△IFN-γ 治疗前21.85±4.375.6±6.880.4±5.974.6±5.7 治疗后23.25±4.477.1±7.936.5±4.7∗18.4±4.8∗△MCP-1 治疗前437.0±86.01 512.0±136.01 608.0±118.01 492.0±114.0 治疗后465.0±88.01 542.0±159.6860.0±93.4∗368.0±97.0∗△IL-6 治疗前133.6±19.4330.4±31.8314.4±34.4310.0±28.4 治疗后143.0±20.4268.6±27.0104.0±21.3∗85.6±19.5∗△IL-10 治疗前40.92±4.2345.87±2.1244.24±2.5445.25±2.52 治疗后40.04±3.2551.24±3.4256.12±4.15∗65.52±2.54∗△IL-4 治疗前12.15±1.8513.26±2.1213.45±2.5413.76±2.52 治疗后12.35±1.6513.43±2.3515.67±2.56∗17.35±2.25∗△

注：*与模型组比较P<0.05；△与BMSCs组比较P<0.05

3 讨论

3.1 ICA与BMSCs的关系 近年来，干细胞领域的快速发展为脊髓损伤等难治性疾病带来了希望，尤其是BMSCs的相关研究最受关注，通过中药复方或有效成分干预可以促进BMSCs的增殖、分化和迁移，提高其生物活性，这也为解决BMSCs移植面临的诸多问题提供了新的思路。ICA是中药淫羊藿的主要有效成分，其药理作用十分广泛。本实验研究发现，一定浓度的ICA可提高BMSCs的活性，但是高浓度的ICA对BMSCs的增殖有抑制作用，这与有关文献报道结论[6]基本一致，而且我们的前期研究结果也得到类似结论[4]。

3.2 TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-10、IL-4在脊髓损伤病理过程中的作用 脊髓损伤后，机体内会产生TNF-α、IL-1β和IL-6等一大批炎症细胞因子，其通过募集白细胞、激活巨噬细胞和小胶质细胞，增加细胞毒性，加速炎症反应，从而加重神经组织损伤，上述这些炎症因子也就成为治疗脊髓损伤的潜在靶点。脊髓损伤后巨噬细胞受到局部微环境中某些炎症因子的刺激可以转化为M1和M2型活化状态。其中M1型巨噬细胞可以分泌TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎症因子，进而加重脊髓损伤程度。诸多研究发现，大鼠脊髓损伤后，TNF-α、IL-1等促炎性细胞因子水平显著升高，细胞凋亡加速[7-10]。本研究结果与上述结论类似，模型组和BMSCs组、BMSCs+ICA组TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6的含量明显高于空白组(P<0.05)，说明脊髓损伤后，促炎症因子高度表达，诱发更加严重的炎症反应。而M2型巨噬细胞可以分泌IL-10和IL-4等有助于清除坏死组织、促进血管再生、组织重建和修复的炎症因子。

3.3 BMSCs治疗脊髓损伤 目前已有大量研究发现BMSCs可以促进脊髓损伤的恢复[11-13]，但是有关其中的作用机制目前还并不明确。本次研究也发现，采用BMSCs移植可以有效改善脊髓损伤区域的炎症反应，促进脊髓损伤的修复。目前虽然已经采用BMSCs移植治疗脊髓损伤，但是致瘤风险依然存在，有关这一难题依然没有得到有效解决。既然机体自身的间充质干细胞可以分化演变，从而修复已经损伤的脊髓组织，只是这一过程极其复杂，影响因素众多。那么我们可以大胆地推测，是否存在一种特殊的媒介或者“催化剂”，可以增强干细胞的活性，促进干细胞定向分化，使脊髓损伤修复的过程得到有效控制呢？这也是目前研究的重点和热点。

3.4 ICA与脊髓损伤的关系 ICA是祖国传统中药淫羊藿的主要活性成分，而中药淫羊藿是中医治疗脊髓损伤组方中至关重要的一味草药。现代药理学研究发现，中药单体ICA具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤、抗衰老、促进骨代谢、抗骨质疏松、增强免疫功能、改善心脑血管功能等多种药理学作用[14]。目前已有研究证明，ICA可以有效抑制TNF-α、IL-6等促炎性细胞因子的mRNA表达，减轻炎症反应，促进神经损伤的恢复[15-16]。本次实验结果显示， BMSCs+ICA组TNF-α、IL-6等促炎症因子的表达水平显著低于其他各组(P<0.05)，但IL-10和IL-4等促进脊髓修复的炎症因子表达水平均高于其他各组(P<0.05)。这就说明适当剂量的ICA可以显著提高BMSCs的活性，抑制脊髓损伤后促炎性细胞因子的表达，改善脊髓损伤区域的炎症反应。虽然本次研究证实了经过适当剂量ICA干预后的BMSCs可以有效减轻脊髓损伤后的炎症反应，但是有关脊髓损伤修复的病理机制十分复杂，影响因素诸多，其中的作用机制或者作用靶点仍然不明确。此外，如何确保BMSCs能够在脊髓损伤区域停留并存活也至关重要。上述这些问题都将是我们下一步研究的重点和关键。

综上所述，适当剂量的ICA可以显著提高骨髓间充质干细胞的活性；ICA与BMSCs联合应用，不仅可以抑制脊髓损伤后TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6等促炎症因子的表达，还可以提高IL-10和IL-4等促进脊髓修复炎症因子的表达水平。依此推断ICA通过提高BMSCs活性，改善脊髓损伤区域的炎症反应，调节脊髓损伤区域紊乱的微环境，从而促进脊髓损伤的修复。BMSCs联合中药单体ICA有望成为治疗脊髓损伤的有效方案。