肌萎缩侧索硬化生物标志物的研究进展

张倩倩，袁宝玉，谢春明

肌萎缩侧索硬化(ALS)又称卢伽雷氏病，常以肢体和球部起病，主要影响大脑皮质锥体细胞和脑干、脊髓中的运动神经元，引起进行性的肌无力、肌萎缩、球麻痹，导致患者全身肌肉瘫痪、吸入性肺炎、误咽和死亡[1-2]。约10%为家族性ALS(fALS)，而大多数ALS病例是散发性ALS(sALS)[3]。高达50%的ALS患者会出现认知障碍，而约13%的患者伴有额颞叶痴呆[4]，为家庭和社会带来沉重的负担。目前ALS的诊断主要依靠临床表现或神经电生理发现广泛上下运动神经元损害的证据，但本病表型存在较大异质性，患者发病至诊断之间会有1年左右的延迟[5]。由于生物标志物具备高度的敏感性和特异性，有助于缩短ALS诊断延迟及监测疾病进展、观察疗效、促进药物研发等，近年来国内外对ALS生物标志物进行了深入探究并取得了一定的进展。本文主要对神经生化、神经电生理及神经影像生物标志物与ALS诊断、监测及预后等方面的关联研究进行综述，阐明ALS生物标志物在临床上潜在的重要作用并探讨后续的研究方向。

1 神经生化

1.1 血液和CSF ALS确切的发病机制不明，目前认为多种机制可能参与ALS的发生发展，如代谢紊乱、氧化应激、RNA加工失调和轴突运输异常等，并在血液和CSF中发现众多潜在的相关生物标志物。

1.1.1 血清肌酸激酶(CK) CK与细胞内能量运转、肌肉收缩直接相关。研究发现，23%～70%的ALS患者血清CK水平轻至中度升高，高水平的CK与ALS患者下运动神经元损伤和肌肉去神经支配的严重程度有关[6]，而肢体发病的ALS患者CK水平显著高于延髓发病者[7]。此外，CK水平还存在性别差异，研究发现男性ALS患者的CK水平显著高于女性[8]。纵向研究显示，ALS患者的CK水平与存活时间负相关，高水平CK的ALS患者死亡风险增加88%[9]。但也有研究指出CK水平的升高与ALS患者的病情进展速度及病情严重程度并不平行[10]。

总之，目前的研究一致认为ALS中可存在CK水平轻度到中度的升高，这有助于临床上早期识别ALS，避免被误诊为肌肉病造成不必要的检查和延误治疗时机[10]。

1.1.2 尿酸 尿酸是嘌呤代谢的主要终产物。血清尿酸可清除超氧化物，防止超氧化物与NO反应形成强氧化剂过氧亚硝酸盐，而高浓度尿酸可延缓神经变性疾病的发展[11]。与健康对照组相比，ALS患者的血清尿酸水平明显降低并与疾病进展速度负相关，与生存时间正相关[12]。更为重要的是，回归分析表明血清尿酸与ALS早期的疾病进展率ΔFS[ΔFS=(48-检查时ALS功能评分量表得分)/症状发作与检查时间之间的持续时间]存在显著正相关，但与ALS晚期缺乏相关性，提示尿酸水平可作为ALS患者早期进展的生物标志物[12]。Meta分析表明, ALS患者的血清尿酸水平明显降低，血清尿酸水平与ALS患者死亡风险呈负相关[13]。与此不同的是，最近的一项研究虽然发现ALS组尿酸水平较健康对照组显著减低，但却未发现血清尿酸与疾病严重程度和进展速度的关联性[14]。

由此可见，尿酸是ALS的保护因素并降低ALS死亡风险，这有助于临床医师对ALS患者病程中出现尿酸水平异常波动的理解。但尿酸水平是否可以作为临床监测ALS进展的生物标志物，能否用于临床评估疾病进展速度，是否具有种群特异性仍存在争议，需要更多的研究去验证。

1.1.3 微小核糖核酸(miRNA) miRNA是一种非编码RNA分子。血液中miRNA十分稳定，具有高度组织特异性、可量化、易于提取和分析等特点，因此具有成为生物标志物的潜力[15]。Takahashi等[16]发现，sALS多种血浆miRNA的表达显著下调，sALS患者血浆总RNA水平与疾病的病程呈负相关，let-7f-5p的表达水平与修订版ALS功能评分量表(ALSFRS-R)的球麻痹分值呈负相关。Chen等[17]对83例sALS患者，24例帕金森病患者和61名健康对照者进行了11种白细胞miRNA表达的检测后发现，sALS组中只有hsa-miR-183水平显著低于帕金森病组和健康对照组，hsa-miR-183可能是sALS的特有生物标志物。此外，与健康对照相比，ALS血清miRNA-206和miRNA-143-3p的表达明显增加而miRNA-374b-5p的表达明显降低，且与是否接受利鲁唑治疗无关。血液中miRNA性质稳定，特异性高，表明miRNA具有作为sALS生物标志物的潜力，有助于临床医师对ALS临床诊断、鉴别诊断和预后判断[18]。

1.1.4 神经丝(Nf) Nf是轴突骨架的重要组成部分，由3个亚基组成：神经丝轻链 (NfL)、神经丝中链、神经丝重链 (NfH)。研究发现，CSF、血清或血浆NfL不仅对ALS诊断具有较高的敏感性和特异性，且可量化症状前ALS的进展[19-20]，而CSF pNfH对ALS检测的特异性高达88.2%，是潜在的ALS诊断生物标志物[21-22]。研究显示，无论是CSF还是血液的pNfH和NfL水平均可用于预测ALS存活率和监测疾病进展，其中CSF pNfH对ALS诊断的准确率最高[23]。

虽然诸多可能的生物标志物研究仍在进行，但目前认为Nf是最有希望的生物标志物，无论是CSF还是血液的NfL、pNfH对ALS临床的诊断、疾病监测、预后判断均具有高敏感性与特异性，在未来临床应用中潜力巨大。

1.2 尿液

1.2.1 神经营养因子受体p75细胞外结构域(p75ECD) 神经营养因子受体p75是神经营养因子的2种受体之一，可介导疾病或创伤后神经元凋亡。与健康对照相比，ALS患者尿p75ECD水平随着疾病的快速进展和运动功能的下降而明显升高，但慢性进展患者中的p75ECD水平则相对恒定，提示尿p75ECD可以作为判断ALS快速进展的潜在生物标志物[24-25]。Jia等[26]研究表明，临床分期越靠后，尿p75ECD水平越高，而快速进展性ALS患者的尿p75ECD水平明显高于缓慢进展者，表明尿p75ECD水平可作为临床疑似ALS患者的附加诊断依据，并可用于评估ALS严重程度。

1.2.2 8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8OH2′dG) 8OH2′dG是DNA受氧化应激损伤的标志物。先前的研究[27]发现，ALS 患者血清中8OH2′dG水平明显高于健康受试者并与ALSFRS呈负相关。在尿液中也有同样的发现，与健康对照相比，ALS患者的尿8OH2′dG水平升高并与ALSFRS-R评分呈负相关，尿8OH2′dG具有作为ALS预后生物标志物的潜力[28]。

尿液检查取材方便、无创，易于在临床推广。尿p75ECD和8OH2′dG可作为临床ALS疾病进展监测和评估严重程度的重要参考指标，有助于指导临床治疗和药物研发中观察药物疗效。

2 神经电生理学

EMG在ALS诊断中具有重要作用，利用针极EMG可发现活动性失神经(纤颤、正锐波和束颤电位)和慢性神经再生的证据[29-30]。EMG中的运动单位数目估计可作为检测ALS病情变化的电生理标志物[31]，但其操作不方便，耗时较长，近年来逐渐被运动单位数目指数(MUNIX)取代。Neuwirth等[32]在为期3个月的EMG测量中发现，ALS患者的MUNIX平均每月损失为5.0%，且变化幅度明显强于CMAP，表明MUNIX对发现运动神经元的丢失具有更高的敏感性，并且可作为监测ALS发展的可靠指标。同时，MUNIX还被证实是评估ALS患者颅内段神经功能的有效指标[33]。另一个受关注的是神经生理指数(NI)，NI可综合反映周围神经近端和远端的功能，计算式为NI=(CMAP波幅/远端运动潜伏期) × F波出现率，研究[34]显示，正中神经NI和尺神经NI与ΔFS均呈负相关，NI记录的下降速度比常规的疾病进展临床指标更敏感，可用于ALS预后的评估。Escorcio-Bezerra等[35]发现平均MUNIX和NI在慢性进展型ALS患者早期即可有显著下降，NI和MUNIX异常可以做为ALS早期评估手段。除此之外，电阻抗成像(EIM)通过测量局部组织阻抗提供肌肉健康的定量数据，被认为是ALS进展的生物标志物，而100 kHz可以作为测量ALS EIM相位值的最佳频率[36]。Shellikeri等[37]发现,与健康对照相比，ALS患者的舌肌相位值小，电阻大，可用来区分ALS与健康对照，舌肌EIM可作为ALS潜在生物标志物。

中国ALS诊断和治疗指南指出，当临床考虑为ALS时需要进行神经电生理检查，以确认临床受累区域为下运动神经元病变，并发现在临床未受累区域也存在下运动神经元病变，同时排除其他疾病[38]。神经电生理检查是临床体检的延伸，对于临床早期识别ALS患者及监测疾病发展具有高敏感性和特异性，临床医师应加以重视并熟练掌握。

3 神经影像

随着神经影像的飞速发展，尤其是PET、MRI等多模态影像的应用极大的拓展了对ALS生物标志物的探索。一项最近的DTI研究显示，与健康对照相比，ALS患者表现为皮质脊髓束(CST)和胼胝体的径向扩散率(RD)、平均扩散率(MD)的增加和分数各向异性(FA)的减少。其中左侧CST的FA值越高，ALSFRS-R评分越高，而RD值与ALSFRS-R评分呈明显负相关，提示RD和FA均可作为疾病严重程度评估的影像生物标志物，而CST可能是ALS受影响最大的脑白质纤维[39]。静息态功能性MRI(rs-fMRI)可通过血流和血氧水平依赖性对比的技术检测早期脑功能活动的细微改变。最近Bueno等[40]通过rs-fMRI对比了20例ALS患者和11名健康对照者的分数低频振幅(fALFF)和局部一致性(ReHo)，结果显示ALS患者局部脑区的fALFF和ReHo值较健康对照者显著降低且与疾病持续时间负相关，是ALS严重程度和进展的潜在影像生物标志物。近年来高场强MRI也成为探索ALS神经影像生物标志物的重要工具。Cosottini等[41]通过使用7 T MRI对22例ALS患者和14名健康受试者的运动皮质扫描显示，ALS患者初级运动皮质深层厚度减少并伴有信号降低，可能是ALS患者上运动神经元损伤的标志。

肌肉超声可检测肌肉的厚度和回声变化，提供肌肉去神经支配的补充证据。有报道指出肌肉超声检测肌束震颤比EMG更为敏感[42]，并在ALS患者中检测出显著的肌肉厚度下降和回声强度的增加[43]。其中，拇短展肌的肌肉厚度和回声强度的联合是ALS诊断和进展监测的可靠生物标志物[44]。

此外，通过使用18F-2-氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG) PET还发现ALS在前额皮质和前运动皮质的代谢减退及小脑、脑干上部和颞叶内侧皮质的代谢亢进，这表明18F-FDG PET同样具有早期区分ALS与健康对照的潜力[45]。

总之，神经影像如MRI早先仅用于ALS的鉴别诊断以除外其他疾病，而如今多模态MRI的广泛应用已成为ALS生物标志物重要的探索工具。基于神经影像发现的结构、功能和代谢等的异常不仅可以作为临床诊断及监测ALS进展、评价治疗效果的重要参考，也有助于临床医师及时识别病情变化并评估干预的疗效。

4 结论

随着不断地深入研究，未来会涌现出越来越多的有潜力的ALS生物标志物，虽然目前尚未出现普遍认可的可应用于临床的ALS生物标志物，但多种技术方法的应用，如蛋白质组学、代谢组学、多重免疫和多模态影像等，同时联合多个潜在生物标志物以提高敏感性与特异性将是下一阶段研究的重点。除此之外，开发更多廉价、方便获取、依从性高的生物标志物，如取材于血液、尿液、唾液等将会降低样本收集的难度，为深入研究减少阻碍。ALS生物标志物的研究不仅有利于探索ALS的发病机制，而且有利于临床诊断和病情监测，所以临床医师也应多重视相关的研究进展，以便在临床工作中更加准确的把握疾病特征，提高诊断的准确性并及时给出有效的干预。