2019年度蜜蜂病毒学研究进展

邓 洁，王 帅，郑火青

（浙江大学动物科学学院，浙江 杭州310058）

2019年国内外发表关于蜜蜂病毒的研究论文共198篇（包括SCI收录论文167篇），专利文献共9篇。这些针对病毒的研究中，大部分涉及了2种或更多种病毒，且与2018年一致：蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV）是国外研究的热点，而囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）是国内研究热点。

167篇SCI收录论文的主要作者共计来自23个国家和地区，发表论文数量最多的国家为中国（39篇），其次为美国（38篇）和英国（12篇）。这些文章涉及60种刊物，其中发表论文数大于5篇的分别是Viruses（13篇）、Scientific Reports（12篇）、Journal of Apicultural Research（10篇）、Insects（8篇）、PLoS One（7篇）、Journal of Invertebrate Pathology（5篇）和Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift（5篇）。

1 病毒流行病学

流行病学是蜜蜂病毒学深入研究的基础。2019年关于蜜蜂病毒的流行病学调查覆盖全球多个国家和地区，所涉及的病毒宿主也更加多样化。

1.1 国外研究新进展

Kevill等在2016年对英国的英格兰和威尔士地区以及美国32个州蜂群内3种类型DWV（即A型、B型和C型）的流行情况和病毒载量进行了季节性调查，同时提供了A型DWV在蜂群水平上比B型DWV的毒力更强的证据[1]。

Rustemoglu和Sipahioglu对土耳其多个地区共90个蜂场的蜜蜂进行了蜜蜂病毒的定性检测，发现蜂群被黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）、DWV、SBV和慢性蜜蜂麻痹病毒（Chronic bee paralysis virus,CBPV）感染，其中BQCV的感染率最高（32%）。在该调查中，蜜蜂样本中均未检测到KBV和IAPV的存在，且被检测到的病毒（BQCV、DWV、SBV和CBPV）的总流行率较低[2]。

de Souza等对巴西的蜜蜂和与蜜蜂紧密接触的无刺蜂（Melipona subnitida）进行了DWV的感染率和病毒量的检测，表明DWV可在不同物种间进行交叉感染[3]。

D'Alvise等对德国西南部16个无患病症状蜂场的1 000多只蜜蜂单只定量检测了11种病毒、4种寄生虫和3种病原菌，结果表明，检出率最高的病毒是BQCV（占84%），微孢子虫检出率达到96%；所有病毒均显示季节性变化，且蜜蜂的低水平感染较为普遍。此外，该研究还表明常见的病原体之间可能存在协同作用，特别是涉及BQCV时[4]。

在墨西哥，研究者定量分析了狄斯瓦螨寄生对当地非洲化蜜蜂（Africanized honeybee）羽化、血细胞浓度、翅完整性和寿命的影响，结果表明在非洲化蜜蜂发育过程中，狄斯瓦螨寄生和DWV感染会导致蜜蜂的死亡、个体发生畸形和细胞免疫被抑制，并能显著缩短成年蜜蜂的寿命，且非洲化蜜蜂成年个体对狄斯瓦螨的耐受性与其自身的免疫机制有关[5]。

Li等报道了美国2株SBV毒株的全基因组序列。低温胁迫实验表明，低温对感染SBV蜜蜂的健康有显著影响，直观表现为幼虫死亡率的升高，说明SBV在春季的高流行率可能和温度的波动有关[6]。

1.2 国内研究新进展

2019年有4篇论文针对国内出现的患病蜂群进行了病毒流行病学分析。王欣欣等对山东省意大利蜜蜂蜂场的CBPV感染情况进行了调查[7]。辽宁锦州医学院团队针对锦州市的SBV和CBPV患病蜂群进行了诊断并提出了防治方案[8,9]。董捷等对浙江省淳安县的患病中蜂进行了SBV的流行病学调查[10]。

此外，本年度对中蜂病毒流行情况的关注较多。通过对福建多个地区共80个中蜂样本进行检测表明，SBV检出率达到90%，DWV检出率为81.25%，以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus,IAPV）检 出 率 为26.25%，而BQCV、CBPV、蜜蜂急性麻痹病毒（Acute bee paralysis virus,ABPV）和克什米尔蜜蜂病毒（Kashmir bee virus,KBV）在所有样本中均未检测到[11]。对2017年1月至2018年7月间台湾北部中蜂和意蜂的SBV流行率的调查表明，SBV在中蜂和意蜂中的平均感染率分别为72%和53%；在中蜂和意蜂同场饲养的情况下，二者SBV患病率逐渐同步，但SBV对意蜂的毒力作用较弱[12]。

近年来关于蜜蜂丝状病毒（Apis mellifera filamentousvirus,AmFV）的研究不断推进。在2019年，阿根廷和匈牙利蜂群内AmFV的流行情况首次通过分子检测手段得到确认[13,14]。在国内，杨大贺等对意蜂群内AmFV的感染情况进行了调查，并解析了AmFV的基因组信息和蛋白质组成。AmFV病毒粒子大小约为200×450 nm，丝状核衣壳长约40×3 100 nm，经过3次叠套，形成“8”字型状态。AmFV中国株序列全长为493 265 bp，GC含量为50.96%，编码253个开放阅读框。病毒关键蛋白共83个，在囊膜组分中存在的有31个，在核衣壳组分中存在的有50个[15]。此外，Wang等的结果表明东方蜜蜂群内的寄生螨上也能检测到AmFV[16]。

2 病毒与其他因子的协同作用

2.1 病毒与寄生螨

2016年3月至2019年6月，Wang等对国内东方蜜蜂群内的2种寄生螨（狄斯瓦螨和恩氏瓦螨）的蜜蜂病毒流行情况进行了跟踪调查，发现在2种瓦螨上都能检测到多种蜜蜂病毒的存在，其中DWV的流行率最高[16]。Sabahi等从伊朗多个省份的12个蜂场采集狄斯瓦螨样本进行了ABPV、BQCV、DWV、IAPV和KBV5种病毒的检测，ABPV、IAPV和KBV均未检出，部分狄斯瓦螨有DWV和BQCV[17]。

Barroso-Arevalo等研究了西班牙南部蜂群内4种蜜蜂病毒（DWV、BQCV、SBV和IAPV）的感染与狄斯瓦螨的寄生情况，发现狄斯瓦螨和DWV是影响蜂群健康的主要因素。为了探讨免疫基因的表达量是否可以作为蜂群健康的生物标记，作者比较了部分蜂群Relish,Defensin,Domeless和Dorsal 4种免疫系统基因的表达水平。结果显示，Relish可以作为判断DWV/狄斯瓦螨感染的指标，Defensin的表达量可以衡量一个蜂群抵抗现有的DVW/狄斯瓦螨感染的能力。作者认为，利用免疫基因作为生物标志物，对这些基因进行监测有助于更好地了解蜜蜂免疫系统的复杂生理机制，可以为控制蜂群内DWV和狄斯瓦螨感染提供新的策略和方法[18,19]。

Zhao等对感染了DWV病毒的狄斯瓦螨和蜜蜂进行了RNA干扰（RNA interference,RNAi）、免疫、创伤反应、DWV病毒滴度及转录组等相关研究。感染早期，DWV病毒滴度较低，Toll通路的Dorsal转录因子水平及其下游免疫效应分子膜肽、蜜蜂抗菌肽和防御素水平较高。狄斯瓦螨和蜜蜂被DWV感染2天后，病毒滴度显著升高，同时相应的免疫效应分子和类泛素蛋白修饰分子（small ubiquitin-like modifier,SUMO）降低。类似的表达模式也存在于RNA干扰、创面/稳态和组织生长通路的基因。研究结果表明，蜜蜂能够对狄斯瓦螨和DWV感染产生即时的、短暂的、有限的免疫和稳态反应，但之后这些途径的下调使蜜蜂容易受到广泛的病毒复制的影响[20]。

Wagoner等对蜜蜂的开盖清巢行为及其机理进行了研究，发现狄斯瓦螨和DWV能引发蜜蜂的卫生行为反应。而引起卫生行为的化学信号在狄斯瓦螨感染的幼虫提取物中也存在，通过对10种碳氢化合物的筛选发现其中2种（Hentriacontene和Tritriacontene）与蜜蜂的卫生行为有关[21]。

Giuffre等对200只狄斯瓦螨的运动行为进行了录像分析，并将其移动的平均速度与病毒载量联系起来，以此来研究狄斯瓦螨的运动行为与病毒载量的相关性。结果发现DWV和SBV均可能在狄斯瓦螨的运动行为中起作用，2种病毒的相互作用通常会使狄斯瓦螨移动得更慢。但病毒载量与狄斯瓦螨行为之间的联系可能远比想象的复杂。在蜂群水平上，蜂螨可能会根据环境条件（例如蜂群、繁殖能力和蜂巢温度等）来改变其行为，而环境条件又会通过影响狄斯瓦螨的运动性而直接影响病毒的传播能力[22]。

2.2 病毒与杀虫剂

百菌清是一种广谱的氯腈杀真菌剂。O'Neal等研究了在田间水平上百菌清对蜜蜂抗病毒、免疫、生化、营养和生长发育形态等指标的影响，这项研究清楚地阐明了百菌清暴露对蜜蜂免疫、营养和发育的亚致死影响，但需要进一步的试验来研究百菌清是如何与蜜蜂生理相互作用以增加与病毒感染相关的死亡率[23]。

Coulon等发现，长期暴露于吡虫啉和被CBPV同时感染的情况下，会导致CBPV病毒载量增加，且CBPV复制与卵黄生成素和dorsal-1a基因转录有关，但未发现吡虫啉和CBPV对蜜蜂的存活有协同作用影响，也没有观察到蜜蜂对该农药有代谢能力[24]。

通过分析蜜蜂大脑中差异表达基因、DWV病毒载量等，Morfin研究了亚致死剂量的噻虫胺和狄斯瓦螨对蜜蜂的影响。与噻虫胺相比，狄斯瓦螨的影响更加普遍；此外，噻虫胺和狄斯瓦螨共同作用后，蜜蜂大脑中的差异表达基因数量反而减少[25]。

2.3 病毒与营养

Dolezal等探索了蜜蜂的食物多样性与病毒感染之间的关系，发现蜜蜂在感染IAPV时饲喂多花花粉或高质量的单花花粉具有降低其死亡率的效果。食物与病毒感染对蜜蜂的死亡率具有显著的影响，这表明良好的饮食可以帮助蜜蜂提高对病毒感染的耐受性。此外，作者还发现花粉缺乏和IAPV感染的情况会增加蜜蜂对幼虫的清除行为[26]。而另一项关于单花花粉和IAPV感染蜜蜂的RNA测序结果表明，约2 000个基因随着饮食质量的改变而改变，但其中只有43个基因存在差异表达，其中一些具有已知的免疫、转录调节和肌肉收缩等功能；通过转录组比较和功能富集分析发现，良好的营养条件能减弱病毒对蜜蜂的影响[27]。

Alger等首次证明蜜蜂能将病毒传播到花朵上，但检测的2种病毒（BQCV和DWV）在植物中分布不均，由此推测花的性状、病毒生态学、觅食行为的差异可能介导了病毒的传播。大黄蜂探访受病毒污染的花朵后并未被感染，这表明通过花朵传播病毒的可能性很小，传播可能取决于多种因素的共同作用，例如：跨物种的病毒株的感染性、宿主免疫能力、病毒毒力、病毒载量和大黄蜂接触被病毒污染的花朵的概率[28]。

3 SBV的研究进展

SBV一直是国内学者重点研究的蜜蜂病毒之一。本年度中文论文中有2篇博士学位论文和2篇硕士学位论文与此相关。

通过给中蜂和意蜂2日龄幼虫及新出房成蜂饲喂SBV，郑彬悦研究了被SBV侵染后中、意蜂幼虫的体重、发育历期、死亡率及成蜂的体重和存活率的变化，探究中、意蜂对SBV侵染的敏感性和致病性差异的机制。试验表明SBV主要对蜜蜂幼虫造成危害，其对中蜂幼虫的致病性要高于意蜂幼虫。SBV对中、意蜂幼虫和成蜂各阶段的发育、营养代谢、免疫相关基因的表达具有不同程度的影响，中蜂幼虫在变态期体内凋亡相关基因的高表达或许是致其死亡的原因，意蜂幼虫在变态期增强了营养、免疫和变态相关基因的表达，使得意蜂得以生存更久甚至能成功化蛹。同时，通过给中、意蜂幼虫先注射Rack1基因的dsRNA后接种饲喂SBV来探究SBV病毒在宿主体内的增殖情况，结果表明蜜蜂Rack1基因对SBV在宿主体内的复制与增殖起到了促进作用，这一结果为蜜蜂囊状幼虫病的研究提供了新的治疗方向与方法[29]。

孙莉通过试验发现SBV可以自然感染意大利蜜蜂的幼虫并导致其死亡。在对SBV病毒株特性进行分析研究后，用灭活的SBV疫苗免疫母鸡制备了特异性卵黄抗体IgY，发现该卵黄抗体可有效防治囊状幼虫病的发生。此项研究成果为SBV的防治提供了技术支持，也为其他蜜蜂病毒的治疗提供了思路[30]。

李明以其所在实验室分离到的SBV相关基因为基础，对目的基因VP2-P-VP1和VP2-VP4-VP1表达获得的目的蛋白抗原性进行了比较，然后选择抗原性较好的蛋白代替SBV作为免疫原，制备了抗SBV单克隆抗体，再利用制备的单克隆抗体研制出了双抗体夹心ELISA检测试剂盒。该试剂盒具有较高特异性、敏感性和准确性，可以用于SBV的临床检测。该实验结果为SBV的快速诊断和早期预警提供了技术支持[31]。

此外，还有很多其他关于SBV的研究进展。例如，刘永梅等研究了SBV在Sf9和S2两种细胞中感染及增殖能力，结果表明SBV不能感染S2细胞，虽能感染Sf9细胞却不能在该细胞中增殖，这可能是因为Sf9细胞含有某类可清除SBV的因子[32]；史红霞等为了研究靶向SBV结构蛋白VP2基因siRNA介导的RNA干扰作用和其对SBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响，通过细胞实验和幼虫实验得到的结果表明SBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi，从而影响SBV在中蜂体内的复制[33]；马跃宇等以SBV的RdRp基因为靶标，选取RdRp-1和RdRp-2两个干扰区域进行了RNAi实验，结果显示干扰片段RdRp-1不能显著下调RdRp基因的转录，而干扰片段RdRp-2可显著性下调RdRp表达并具有剂量依赖性，表明RdRp基因可以作为用于SBV防治的RNA干扰靶标[34]。

4 新病毒和新病毒株的发现

Levin等通过宏基因组学分析发现2种新型的蜜蜂病毒株：Varroa Orthomyxovirus-1（VOV-1）和Hubei Virga-like 14 Homolog Virus（VDV-4）。相比蜜蜂，VOV-1在狄斯瓦螨中更常见[35]。

Herrero等也在狄斯瓦螨上发现了3种新的病毒，其中2种是VDV-2和VDV-3的变体（基因组相似度达到75%），VDV-5为首次被报道[36]。

5 蜜蜂病毒相关专利

蜜蜂病毒相关的专利集中在病毒病的预防、治疗和病毒检测试剂盒上。2019年公布的专利中，5项与病毒病的预防与治疗相关，其中针对CBPV的有2项、SBV和DWV的各1项，另一项是通过限王产卵等方式预防和控制病毒性疾病对蜂群造成损害。检测试剂盒一般针对多种病毒，部分针对单个病毒设计，如用于检测IAPV的RT-PCR检测试剂盒。

6 其他

6.1 西奈湖病毒（Lake Sinai virus,LSV）

为了更好地了解LSV的进化史，Cornman对GenBank上的LSV分离株的开放阅读框、取代率变化和密码子使用等进行了评估，结果发现LSV密码子的使用与蜜蜂及其他常见的蜜蜂病毒有显著的不同，这表明LSV与宿主并没有很强的协同进化关系。同时，通过从SRA序列中重建的LSV分离株的系统发育位置和相对丰度的分析表明，在公共数据库中，相对于LSV1和LSV2的姐妹谱系，这二者的检测偏差可能过高[37]。该研究进一步阐明了LSV分支的相对分布，确定了分子进化的模式，为今后的研究奠定了基础。

6.2 病毒对蜜蜂触角功能的影响

DWV病毒量升高可能会损害蜜蜂的感知和沟通能力，Kim等便调查了有无DWV致病症状的蜜蜂触角内病毒的存在、位置和富集情况，发现病毒粒子仅在有症状个体的触角上皮基底区发现，且这些区域存在准晶体阵列，表明这些组织内病毒正在进行复制。被感染区域的完整性也遭到损害，这意味着正常的触角功能和依赖于触角功能的卫生等行为也可能受到了不利影响[38]。

7 结语

蜜蜂病毒有种类多、易变异、相关因素多等特点，对蜜蜂的影响非常复杂，有很多问题都值得深入研究。近年来，蜜蜂病毒相关研究报道呈井喷式增长，研究内容精彩纷呈。这些研究促进了人们对蜜蜂病毒的认识，有利于养蜂生产上对蜜蜂病毒病的防控。但由于合适蜜蜂细胞系的缺乏，蜜蜂病毒学中2个重要的课题——蜜蜂病毒的致病机理及有效药物的筛选仍处于几乎空白的状态，亟待解决。