常压敞开式离子化质谱在肿瘤诊断中的研究进展

张佳玲

(德克萨斯大学奥斯汀分校 化学系，德克萨斯 奥斯汀 78712，美国)

近年来，质谱技术凭借其本身具有的灵敏度高、特异性强和分析速度快的优势，在临床诊断中的应用越来越广泛。质谱在临床领域，如新生儿疾病筛查[1]、甾体激素检测[2]、微生物检测[3]、呼吸物检测[4]等中的应用，相关综述均进行了详尽阐述。目前，质谱在肿瘤诊断方面常见的技术主要包括液相色谱-质谱联用(Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry，MALDI-MS)。自2004年常压敞开式离子化质谱(AIMS)被报道以来，该技术领域近几年在肿瘤诊断中的应用越来越受到关注。在过去的多年间，已有多篇AIMS相关的综述报道[5-6]。本文结合前期研究工作，主要针对不同AIMS技术在人体肿瘤，尤其是肿瘤诊断中的研究进行了总结，并展望了该技术在未来发展的可能趋势。

1 基于喷雾的AIMS

1.1 解吸附电喷雾离子化(DESI)

Cooks课题组于2004年报道了具有开创意义的解吸附电喷雾离子化质谱(Desorption electrospray ionization mass spectrometry，DESI-MS)[7]。目前DESI技术已广泛应用于各个不同的领域，并且有多篇综述对其进行了总结[6，8-9]。最早见于报道的将DESI-MS应用于癌症组织分析是在2005年，Wiseman等[10]对人肝腺转移癌进行了分析，在正离子模式下，DESI-MS质谱图显示肝癌组织样品中鞘磷脂的峰强度高于正常组织样品。2009年，DESI-MS对人体乳腺癌样品的组织成像首见报道[11]。目前，DESI-MS是最广泛地被应用于人类癌症组织分析的技术之一，其应用涉及乳腺癌[12]、脑癌[13-17]、肝癌[10]、前列腺癌[18-19]、肾癌[20]、膀胱癌[20]、胃癌[21-22]、结直肠癌[23-24]、甲状腺癌[25]、皮肤癌[26]、肺癌[27-28]及淋巴转移癌[21，29]等。需指出的是，以上应用均处于研究阶段，并未经美国食品药品管理局(FDA)批准，因此均未被应用于实际临床诊断。

再帕尔·阿不力孜课题组于2011年报道了空气动力辅助离子化技术(Air flow-assisted ionization，AFAI)，也称为空气动力辅助解吸附电喷雾离子化技术(Air flow-assisted desorption electrospray ionization，AFADESI)，该技术可实现开放环境下离子的远距离传输，消除样品检测的空间限制和增加分析的灵活性[30]。在肿瘤组织诊断方面，该实验室也对不同疾病展开了研究。2015年，Li等[31]利用AFADESI对52个人肺癌样品进行分析，发现了脂类、氨基酸、胆碱、多肽以及左旋肉碱等生物标记物，并且灵敏度和特异性可分别达到93.5%和100%。2016年，Mao等[32]利用AFADESI对乳腺癌中2种非常重要的乳腺导管原位癌和浸润性导管癌进行了区分。而在最近，Sun等[33]通过对256例食管癌病人的分析，详细讨论了来自不同代谢通路的多种代谢物分子。值得一提的是，研究者发现Pyrroline-5-carboxylate reductase 2(PYCR2)和Uridine phosphorylase 1(UPase1)这2个代谢通路与食道鳞状细胞癌相关。

在DESI成像方面，本课题组在过去几年间分别对胃癌，嗜酸细胞瘤和甲状腺癌展开了研究。2012年，Eberlin等[22]对术中胃癌组织快速冷冻样品进行了分析，以帮助外科医生术中快速诊断，为确认癌症边缘提出了新的解决方案。该研究对62例组织库的人胃部样品进行分析，通过统计学方法对所获得的12 480个质谱成像数据进行训练，寻找重要的生物标记物，建立统计学预测模型，经过一系列优化，可获得近98%的准确率。不仅如此，利用该统计学模型，对21例实际术中胃部边缘样品进行预测，结果显示可以获得与病理学专家相当的结果。

嗜酸细胞瘤(Oncocytic tumor)是一类少见的良性肿瘤，细胞层面表现为线粒体的过度积累。已有研究表明，这类肿瘤的发生与线粒体DNA的突变相关，然而对于该类肿瘤细胞的脂质分子信息的研究目前尚未见报道。利用DESI质谱成像，本实验室对正常甲状腺样品、嗜酸细胞瘤和非嗜酸细胞瘤3种不同的样品组织进行了分析[25]。结果显示，在嗜酸细胞瘤中有一类特殊的分子——心磷脂在其中的含量远高于另外2种组织。心磷脂分子相比于其他脂类分子的特殊之处在于它可同时携带2个电荷。此外，研究还发现了17种被氧化的心磷脂分子，且只存在于嗜酸细胞瘤中。采用不同的染色方法交叉验证质谱的实验结果，如免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry，IHC)和荧光染色，均得到与质谱成像一致的结果(图1)。

图1 DESI成像和甲状腺线粒体分离实验流程[25]

甲状腺结节的发病率近些年在许多国家逐年攀升。然而，临床上对该疾病穿刺样品是否为癌症的诊断仍较为困难，由于样品中细胞数量较低或形态不规则，占该类疾病20%的样品往往只能够给出不确定的诊断结果。尽管基因组技术逐渐被应用于该类疾病的诊断，但效果仍然有限。本实验室通过对178个病人组织样品，包括正常组织、良性滤泡状腺瘤(Benign follicular adenoma，FTA)、恶性滤泡状腺瘤(Malignant follicular carcinoma，FTC)和乳突癌(Papillary carcinoma，PTC)使用DESI成像技术进行分析，共获得了114 125个质谱图数据[34]，对这些数据进行训练，所获得的统计学模型被用来预测临床上的穿刺样品，可得到大约90%的预测准确率，证明了质谱成像不仅可用于组织样品分析，在细胞分析上也有其独特的应用。

1.2 探针电喷雾/纸喷雾/生物组织喷雾/指诊喷雾(PESI/Paper Spray/Tissue Spray/Swab Touch)

基于探针的质谱技术研究在近几年逐渐引人关注，其基本原理存在一定相似之处，即均需制作带有尖端的探针。早在1999年，中山大学谢建台课题组[35]就报道了无需毛细管，只需铜线即可产生电喷雾的离子化装置。2010年，欧阳证课题组[36]报道了纸喷雾离子化(PS)质谱。PS的工作原理是将纸剪成带有尖端的形状，将所要分析的样品在纸片上进行上样，当在纸片上滴加溶剂并施以高压时，纸片尖端会产生电喷雾，从而将样品离子化。PS被广泛用于血液、尿液、唾液、粪便等样品的分析[37-38]。此后，一系列相似原理的技术相继被报道。2013年，Mandal等[39]使用探针电喷雾(Probe electrospray ionization，PESI)对4例正常和癌变的结肠样品进行分析，通过主成分分析可清晰地将两者区分。2015年，Kerian等[40]在前列腺组织样品表面使用棉棒进行简单接触，通过指诊喷雾(Touch spray)对来自6个前列腺病人的70个样品进行非靶向分析，最终所获得的110个数据的准确率为93%。2017年，Pirro等[41]利用指诊喷雾对29个人体胶质母细胞瘤进行了分析，在指诊喷雾的图谱中可清晰地观察到重要的生物标记物N-Acetylaspartate(NAA)。而对2-Hydroxyglutarate(2HG)的表征则可以用来评估Isocitrate dehydrogenase(IDH)突变的状态，因此该方法在手术中的快速诊断方面具有很大的应用潜力。在基于探针的方法中，还有一种方法为生物组织喷雾(Tissue spray)，该方法直接利用样品组织在尖端产生喷雾而将样品离子化。Kononikhin等[42]使用该方法，利用丰富的脂质信息，对人体脑坏死组织和脑瘤组织的质谱图进行了对比，证明了该方法具有区分不同组织的潜力。2015年，Wei等[43]使用38组人体肺部样品，通过组织喷雾，对肺部鳞状细胞癌(Lung squamous cell carcinoma)以及相邻正常组织进行了分析，在统计学方法的辅助下，使用偏最小二乘判别分析(Partial least squares linear discriminant analysis，PLS-LDA)，对癌症的判别准确率达94.42%，并且整个分析过程可在1 min内完成。2018年，Adamyan等[44]使用组织喷雾对子宫内膜异位症(Endometriosis)、腹膜子宫内膜异位症和正常子宫内膜3种样品进行了质谱表征，并讨论了3种组织中具有显著差异的15种不同的脂类分子。

2 基于电烧蚀的AIMS：快速挥发电离质谱(REIMS)

2009年，Zoltan实验室[45-46]报道了一种快速挥发电离质谱(Rapid evaporative ionization mass spectrometry)，也称为智能手术刀(iKnife)。该技术的工作原理是：首先对所要分析的样品进行电烧蚀(Cauterization)，电烧蚀过程中会产生含有样品的气溶胶，通过文丘里空气泵(Venturi pump)将气溶胶导入自制的离子源中进行离子化，最终进入质谱，从而得到待分析样品的分子信息。2017年，St John等[47]利用iKnife对多发性乳腺癌展开了研究，该研究中对正常乳腺组织样品和肿瘤组织使用线性判别分析(Linear discriminant analysis，LDA)建立了统计学模型，932个样品数据可获得93.4%的灵敏度和94.9%的特异性。利用该模型，对另外161个正常样品和99个肿瘤样品进行了预测，获得了90.9%的灵敏度和98.8%的特异性。该技术术中操作以及数据分析过程可在短短的1.8 s内完成。2018年，Phelps等[48]对来自198例人体卵巢癌的335个样品组织进行了分析，交叉验证结果显示对正常卵巢样品和卵巢癌样品的辨别可达到97.4%的灵敏度和100%的特异性。而对具有非常重要临床意义的卵巢癌边缘样品的鉴别，灵敏度和特异性仍高达90.5%和89.7%。此外，该研究还发现了5个磷脂酸和磷脂酰乙醇胺脂质分子在卵巢癌样品中的含量远高于正常或者边缘卵巢样品。

3 基于激光的AIMS

3.1 SpiderMass

SpiderMass是在2016年被Fourier实验室报道[49]的基于激光的质谱分析技术。Fatou等认为该技术的工作原理是通过使用共振红外激光对所要分析的样品进行解吸附，样品本身存在的水分子作为基质，以类似于基质辅助激光解吸/电离的过程产生离子，借助质谱本身的真空直接被导入质谱。在首篇报道中，采用SpiderMass对人体的皮肤进行了分析，并对采集的不同性别数据进行了主成分分析。2018年，Saudemont等[50]采用该技术对体外犬类肉瘤组织进行了研究，并对正常、肿瘤和坏死组织进行了区分和鉴定，准确率高达97.63%。此外，还对发现的可能生物标记物进行了多级质谱以及质谱成像分析。

3.2 飞秒红外激光常压敞开式离子化质谱(PIRL)

2015年，Zarrine-Afsar实验室利用皮秒红外激光(Picosecond infrared laser，PIRL)在切除组织时不会造成热损伤这一特性，将其与电喷雾相结合(PIRL-LAESI)对生物样品进行分析[51]，发现PIRL的垂直分辨率为20～30 μm，水平分辨率约100 μm，且该技术可同时获得脂质分子和蛋白质分子的质谱信号。2017年，Woolman等[52]将该装置进一步简化，使用手持式PIRL激光装置，再通过聚四氟乙烯导管与质谱直接相连，将产生的离子最终导入质谱分析仪。最近，Woolman等[53]探究了使用PIRL-MS对髓母细胞瘤利用分子信息做术中快速判断肿瘤亚类的可能，研究对来自113个病人的样品进行分组，其中71例为训练组，42例为独立验证组，使用主成分分析-线性判别分析(Principal component analysis with linear discriminant analysis，PCA-LDA)，训练组的预测准确率可达95%，验证组的预测准确率高达98.9%。

4 基于液相固相萃取的AIMS

在AIMS领域中，利用液相固相萃取原理的技术包括液体表面萃取分析(Liquid extraction surface analysis，LESA)[54]和液体微界面表面取样探针(Liquid microjunction-surface sampling probe，LMJ-SSP)[55]。 然而，以上技术在肿瘤组织分析方面的相关工作鲜见报道。2017年，本实验室报道了一项名为质谱笔的技术，利用该技术主要针对肿瘤组织诊断开展了相关研究工作。

4.1 质谱笔用于组织的无损伤分析

2017年，本实验室报道了可用于ex vivo或者in vivo生物样品癌症诊断的质谱笔(MasSpec pen)技术[56]。质谱笔的工作原理是：首先笔的末端与样品表面接触，通过脚踏板的触发，由注射泵自动在笔末端的凹槽内以脉冲的方式注射一滴10 μL水滴，该水滴与样品进行3 s的萃取后，含有生物样品分子的水滴会通过直接连接质谱进样口的管路，在未经过外接离子源的情况下，直接进入质谱中被离子化(图2)。需指出的是，该技术的离子化机理尚不完全清楚，仍有待研究。研究分析了20例人体样品的组织切片以及253例人体组织样品，包括甲状腺、肺、乳腺以及卵巢的正常和癌症样品。在不同人体样品中，质谱笔可检测到丰富的分子信息，包括低分子量的代谢物分子、脂类，甚至是蛋白分子。采用统计学方法对所获得的质谱数据进行分析，结果显示对正常组组织和癌症组织区分的灵敏度和特异性分别达到96.4%和96.2%，准确率为96.3%。最后，对活体小鼠进行分析，发现分析过程不会对小鼠造成任何明显的损伤。

图2 质谱笔装置示意图[56]

4.2 质谱笔用于分析卵巢癌

卵巢癌是一类具有转移性并且致死率较高的癌症，尤其以高分化浆液性卵巢癌(High-grade serous carcinoma，HGSC)和低分化浆液性卵巢癌(Low-grade serous carcinoma，LGSC)最为常见。本实验室利用最近发明的质谱笔技术(图3)对该疾病展开了详细研究[57]，对138个卵巢样品(71个正常，60个HGSC，7个LGSC)进行了分析。统计学模型显示，对于正常和HGSC的区分可获得96.7%的灵敏度和95.7%的特异性，对于正常和所有分析的癌症组织的区分可获得94.0%的灵敏度和94.4%的特异性。值得一提的是，该研究还对高分辨Orbitrap和低分辨的离子阱2种高低端仪器进行了比较，发现使用分辨率较低的质谱对于20个正常卵巢样品和20个HGSC样品可以得到100%的准确率。

图3 质谱笔对卵巢样品的分析[57]

5 展 望

AIMS具有简单，可在开放环境下操作，无需或者只需很少的样品制备等优势，经过多年的发展，已经成功应用于众多生物、化学分析领域，尤其是临床领域研究。需再次指出的是，目前还没有一项AIMS技术得到美国食品药品管理局FDA的认证。已报道的AIMS方法有30多种，并且科学家仍然在不断地对离子化装置进行改进，以提高易用性和自动化。本文针对几种不同类型的AIMS技术，结合本实验室的研究，对其在肿瘤诊断中的应用进行了总结和整理。未来将AIMS应用于临床仍然任重道远，面临如定量能力、基质效应、数据的代表性/指纹图谱的可靠性等一些严峻的问题。AIMS与传统的液相色谱-质谱联用或气相色谱-质谱联用可形成优势互补，存在的问题可以相互佐证。未来随着AIMS技术分析的标准化和规范化的增强，结合目前的大数据分析，相信AIMS的稳定性和可靠性也一定会进一步得到提升。此外，小型化质谱已经成为目前该领域研究的最热点之一。将AIMS的原位分析能力与小型质谱的便携功能结合，将会极大地促进该技术在临床领域中的应用。