中药植物玉竹微卫星标记的筛选及遗传多样性分析①

(1．皖南医学院基础医学院病理教研室, 安徽 芜湖 241002；2．安徽师范大学基因疾病与健康生物医学安徽普通高校重点实验室,安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室,安徽省中药日化产品工程技术研究中心, 安徽 芜湖 241000)

0 引 言

微卫星标记(Microsatellite)，又称简单重复序列(Simple Sequences Repeats，SSRs)。广泛存在于原核生物以及真核生物的基因组中，通常位于基因组的非编码区中。

玉竹是百合科黄精属多年生草本植物，主要分布在长江流域[1]，是一种重要的药用植物，具有养阴清热、生津止咳功效，因此被广泛种植并应用于中药制作。近年来，有报道称，来自玉竹根状茎的同质异黄酮可能能够抑制高级糖基化终产物的形成，因此，这种植物可以作为一种新型的自然产品来减轻糖尿病并发症[2]。此外，玉竹根状茎常被用作冠状动脉心脏病、糖尿病、肺结核和再生障碍性贫血等疾病的辅助疗法。玉竹还具有很强的观赏性，是不可多得的观赏佳品。我国医药业对玉竹的需求量非常巨大，然而，大量的森林砍伐和环境变化导致玉竹野生种群数量急剧下降。

玉竹的形态已经被广泛的研究，包括花粉形态[3]，核型和细胞分类学[4]。虽然有两种黄精属的多态性微卫星位点的报道[5～6]，但还没有针对玉竹微卫星引物的报道。为了分析玉竹自然种群的遗传多样性和遗传结构，本文描述了核微卫星标记物[7]的发展。为今后保护和合理利用玉竹资源具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材 料

选取安徽省岳西县鹞落坪自然保护区11个玉竹样品，云南省昆明9个玉竹样品，安徽省琅琊山20个玉竹样品为材料。新鲜叶片经硅胶干燥后于-20 ℃保存。选取玉竹干燥后的叶片样品，经液氮研磨，提取新鲜叶片基因组DNA。

1.2 方 法

1.2.1 基因组的提取和酶切

采用改良CTAB法提取玉竹叶片中基因组DNA[8]，运用磁珠富集法[9～11]，对多态微卫星位点进行了分离和鉴定。本实验所提取的玉竹基因组DNA需要检测其浓度以及纯度，这一进程需要使用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳，提取的DNA在-20℃下保留备用，再利用限制性内切酶Sau3AI对500 ng基因组DNA进行酶切。PCR反应体系(20 μl)为：DNA 1 μl，10 x Buffer 2 μl，Sau 3AI酶1 μl，无菌水补充至20 μl，用琼脂糖凝胶纯化试剂盒对300～900 bp的产物进行纯化。

1.2.2 酶切产物与接头连接和富集微卫星片段

由两个接头OligoA(5’-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’)和OligoB(5’-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’)将上一步中纯化的片段连接起来。连接引物的DNA片段在95 ℃下变性10 min，杂交化的单链3’亲和素标记的(CT)15Oligo探针在65℃下退火30min,在磁珠悬浮液中加入“微卫星探针-包括微卫星DNA的单链DNA”复合体，充分摇匀，室温搁置30 min，在搁置期间需间断轻轻摇匀，将悬浮状态的磁珠沉淀下来。通过上述方法得到单链DNA片段，需经过PCR扩增将其恢复为DNA双链，另外为了后续的TA克隆做充足准备，需通过GoTaq⑧DNA聚合酶在其末端加A。PCR反应体系如下：

25μlPCR富集反应体系

PCR反应程序如下：94°C预变性4min；94°C变性45s，在最优退火温度中复性35s(表1)，72°C延伸30s，35个循环；72°C终延伸8 min[12]。

1.2.3 微卫星文库构建及阳性克隆菌株的菌落PCR检测

通过磁珠富集法获得了PCR产物，对其进行纯化浓缩，并将Ligation Mix 5 μl、pMD19-T vectors(TaKaRa)1uL, PCR产物4 uL加入到微量离心管中，通过短暂离心使上述混合液汇集到管底，之后将其在16°C低温水浴连接2h。通过转化及蓝白斑筛选，挑白色菌落取阳性克隆，挑至含Amp的LB液体培养基中，37 ℃ 225rpm 振荡培养4 h。用接头引物Oligo A和引物(CT)15进行菌落PCR，PCR反应体系如下：

15 μlPCR验证反应体系

PCR扩增程序：在94°C下预变性3min；94°C变性35s，60°C退火35s，72°C延伸1min；共30个循环；72°C延伸10min[12]。检测得到具有两条或三条含微卫星片段的阳性克隆。

1.2.4 多态性微卫星位点的筛选与数据分析

对55个阳性克隆进行了测序，其中包含了大量二核苷酸和三核苷酸的重复序列，使用PREMIER 5.0软件为包含重复序列(26 bp ≤ 重复序列≤ 65 bp)的基因位点设计四十五对引物，对3个玉竹自然种群的40个个体的等位基因多态性进行筛选能稳定扩增的引物(表2)。用摸索好最适扩增条件的引物对3个玉竹自然种群的40个样品进行扩增，从中筛选出可稳定扩增的引物。利用琼脂糖凝胶电泳技术对PCR扩增后的产物进行检测,然后使用变性剂在95℃变性8 min，然后再进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测，对电泳条带进行分析，利用遗传数据分析[13]计算HE和Ho，并测试是否偏离位点间的连锁不平衡以及哈温平衡。利用CERVUS 3.0软件[14]测定多态性信息和等位基因数量(表2)。表1列出了新开发的微卫星位点的详细信息。

2 结果和分析

表1列出了新开发的微卫星位点的详细信息。获得了9个多态位点，其中5个位点具有多态性，每个微卫星位点的Na数目从3到6个不等，其平均数为4.2。这些微卫星位点的H0范围为0000～0.875；HE范围为0.520～0.760。哈迪-温伯格平衡检测表明，5个多态位点均符合哈迪-温伯格平衡，位点Pc4,Pc5,Pc6 和Pc7显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.05)，这可能是扩增过程中出现了无效等位基因。在12个位点中进行两两比较(Po2-Po3,Po1-Po5,Po2-Po5,Po3-Po5,Po2-Po7,Po5-Po7,Po5-Po8,Po7-Po8,Po1-Po9,Po3-Po9,Po5-Po9,Po7-Po9)表现出显著的位点间的连锁不平衡。本实验的样本容量较小是偏离连锁不平衡和哈迪-温伯格平衡的原因之一。偏离哈迪-温伯格平衡的原因也可能是地理上的限制。在当前研究中4个位点偏离的一个重要原因是人口数量。野生环境中遗传多样性的减少很可能是由于人类活动的影响。长期以来人类活动的影响可能导致了本研究中所筛选的等位基因多样性较低。但开发的这些多态微卫星DNA标记可以用来评估玉竹和其他相关物种的遗传变异。此外，这些标记物可以作为未来标记辅助育种的微卫星的潜在来源。

表1 从玉竹中获得的9对多态性微卫星位点的特征

* 表示明显偏离Hardy-Weinberg平衡(P< 0.05).Ta为最佳退火温度

表2 由玉竹微卫星标记获得的种群参数

N：样本量; Na: 等位基因数; HO：观察杂合度HE：预期杂合度; PIC：多态信息含量

3 讨 论

本研究通过构建微卫星文库，采用磁珠富集法开发玉竹微卫星，成功得到了多态微卫星并应用于玉竹不同种群的遗传结构分析中。传统方法直接从基因组文库中筛选微卫星位点，费时间，效率低。磁珠富集法是一种快速、高效的构建微卫星富集文库的方法，近年来，磁珠富集法被广泛应用于动植物的微卫星标记的开发研究中[9～11]。

在实验过程中，采用实验室往届彭艳秋等人的方法[15]，阳性克隆率可达30-40%。一些关键步骤在磁珠富集的过程中值得讨论。首先，获取高质量的玉竹基因组DNA是整个实验的关键步骤。高质量的基因组DNA是后续步骤的有利保证，如文库构建和引物筛选。其次，接头与酶切后基因组DNA片段连接效率的高低也影响了实验的顺利进行，连接效率可以通过连接后PCR扩增产物的琼脂糖电泳照片来判断。最后，磁珠富集是过程中最为关键的一步。杂交后的洗脱条件对磁珠富集来说是重要的影响因素，其中洗脱条件包括洗脱温度以及洗涤的严谨度。如果洗脱温度高，SSC浓度低，洗脱过程动作过于剧烈，这样会导致很多含有微卫星的片段丢失；如果洗脱条件不够严谨，就可能会产生非特异性片段，使文库中产生假阳性克隆，因此，根据磁珠的使用说明，并调整实验中的若干洗脱条件才能达到最佳的富集效果。

4 结 语

本实验中，观察杂合度高于预期杂合度，说明该玉竹居群遗传多样性较好。一般通过哈温平衡定律来衡量群体遗传结构是否稳定。本研究利用9对微卫星引物对安徽滁州琅琊区玉竹居群进行遗传多样性分析,发现其中4个位点偏离Hardy-Weinberg平衡常数(p<0.05)。这一结果造成的主要原因可能是：

(1) 位点间的连锁反应以及非等位基因之间遗传共适应的差异。基因连锁是指位于同一染色体上的不同位点的非等位基因之间的非随机组合效应。如果位点之间出现连锁反应，会造成非等位基因之间的连锁不平衡现象，最终形成的配子的概率会出现偏离哈温平衡的现象[16]。在自然群体中，连锁不平衡现象会出现在中性位点；而在随机交配群体中，连锁不平衡现象不强烈[17]，本实验中连锁不平衡分析表明有12对位点出现了连锁不平衡，分别是(Po2-Po3,Po1-Po5,Po2-Po5,Po3-Po5,Po2-Po7,Po5-Po7,Po5-Po8,Po7-Po8,Po1-Po9,Po3-Po9,Po5-Po9,Po7-Po9)(p<0.05)，在一定程度上可能也导致哈温平衡偏离现象。

(2) 样本数量地域较小。增大玉竹采集的地域和数量，比如扩大到整个安徽的玉竹居群，甚至全国范围内的玉竹可能会增大位点等位基因的数量。

(3) 群体本身处于日益濒危状态与近亲繁殖。玉竹作为中药材需求量巨大，野生玉竹无法满足市场的需求，而且近年来滁州经济的开发对玉竹的生境影响较大。同时，当玉竹面临环境胁迫时候，会采用无性繁殖的方式，这对物种的基因交流产生不利影响。

(4) 无效等位基因的出现。通过软件Micro-Checker的分析发现，偏离哈温平衡常数的4个位点中都有无效等位基因的出现。因此，我们认为导致上述情况发生的主要原因可能是位点间连锁不平衡以及无效等位基因的存在。采集不同地域之间的玉竹，扩大样本数量，将可能有助于进一步分析遗传结构。

近年来，野生中药植物资源的生境急剧恶化，种质多样性下降，运用现代分子生物学技术对中药资源进行研究、创新及再生，以科技为先导，通过诸如中药分子标识育种、组织细胞培养、药用植物基因和基因工程等方法，实现中药资源的长期可持续发展战略，对促进经济发展和中药资源利用与保护具有重大而又深远的意义。