芽孢杆菌菌株TYF-B5-5的产乙醇特性及其全基因组测序分析

郭宴君，樊璐璐，何永吉，郭春绒，范晓军

（1.山西农业大学文理学院，山西太谷030801；2.太原理工大学环境科学与工程学院，山西太原030024；3.山西省农业科学院农产品加工研究所，山西太原030031）

在自然界中，木质纤维素的含量非常丰富，作为可再生资源，它广泛存在于蔬果废物、木材木屑、纸浆废物及草本作物中。据报道，我国每年约产玉米秸秆7亿t[1]，而大多数玉米秸秆被焚烧，造成了严重的环境污染。乙醇是石油燃料的主要替代品之一，而用于发酵生产乙醇的原料中木质纤维素是最具有经济效益的一种原材料[2-4]。可利用木质纤维素生产乙醇的细菌绝大部分都具有特殊性质，据报道，现有包括真菌、细菌在内的近200种微生物，可以降解木质纤维素[5-6]。韩如等[7]对嗜热细菌直接转化纤维素产乙醇进行了探究，结果得出，以玉米秸秆为底物时乙醇产量在250～300 mg/L；ZIABREVA等[8]提出，乙醇产率受pH值的影响极大，合适的pH值甚至可以提高6倍左右的乙醇产率。

嗜热细菌存在的生物技术潜力，从各种底物生产乙醇的能力以及某些物种降解木质纤维素的能力越来越受到人们的关注[9]，在嗜热细菌中，糖热厌氧杆菌可以降解木质纤维素，并且适用于高产乙醇的研究，但早期就认识到缺乏基因组信息是研究的关键限制[10]。

本研究中菌株TYF-B5-5是太原理工大学分子生物学实验室从山西老陈醋成品醋液中筛选分离出的1株耐高温细菌，该实验室报道了它的完整基因组。由于食醋生产工艺的特殊性，导致菌株TYFB5-5存在可降解木质纤维素的特性，具有广泛的底物谱，且主要代谢产物为乙醇，可利用天然玉米秸秆发酵代谢。本研究通过培养基优化使乙醇产率达到最佳，并从基因组学的角度加以证明，结果将为学者更好地研究嗜热菌降解木质纤维素提供途径。

1 材料和方法

1.1 材料

供试芽孢杆菌菌株实验室编号为TYF-B5-5。

1.2 试剂与仪器设备

木糖、葡萄糖、木聚糖、微晶纤维素，生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化学试剂均为分析纯。TS-8S摇床，苏州培英实验设备有限公司；ZHJH-C1109B超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；气相色谱仪，日本岛津。

1.3 方法

1.3.1 菌种的分离鉴定与发酵条件确定 使用MRS固体培养基对成品醋样进行初筛，随后挑取单菌落用加入乙醇的液体培养基复筛。使用基因组提取试剂盒（TIANGEN）提取菌株TYF-B5-5的基因组，用通用引物27F、533R和1492R进行扩增（表1），其产物进行Sanger测序，用NCBI网站对测序产物进行Blast同源比对，查找与菌株TYF-B5-5的16SrRNA相似度较高的物种。

表1 菌株TYF-B5-5的16S rRNA扩增引物

种子液扩大培养基。MRS（蛋白胨10g/L，酵母粉4g/L，牛肉粉8g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸氢二铵 2 g/L，乙酸钠 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.19 g/L，吐温 -80 1 mL/L）液体培养基，置于烧瓶培养。菌种于MRS固体培养基保藏，对斜面上保存菌种进行适量挑取，用于菌种复苏，在5 mL试管37℃、200 r/min过夜培养；随后，将其倒入装有50 mLMRS的培养基中进行扩大培养，所得的种子培养物接于发酵培养基中，并在37℃、200 r/min下培养。

1.3.2 发酵代谢物分析及产物优化 通过常规的紫外分光光度计在600 nm（OD600）处测量光密度来检测细胞密度。乙醇的浓度测定通过备有Agilent HP-FFAP气相色谱柱的日本岛津气相色谱仪进行检测，乙醇浓度通过内标法计算，程序设定参照董晓亚等[11]的方法进行，进样量1 μL，所有样品均于12 000×g、10 min下离心，并通过孔径为0.22 μm的过滤器。

在MRS培养基基础上，将葡萄糖分别换为20g/L半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、D-木糖、秸秆、微晶纤维素以及木质素，用作优化发酵培养基的基本培养基。在温度35～60℃，pH值4.5～8.5内培养36 h后取样以进行乙醇优化。

1.4 全基因组数据处理分析

经电泳检测合格的DNA样品可进行后续的文库制备，库检合格后采用Illumina HiSeq 2000测序平台进行测序。基因组信息分析流程如图1所示。

为保证信息的准确可靠，将获得的原始数据进行过滤处理，得到有效数据。使用组装软件对Clean Data进行基因组组装[12-16]，最终组装结果与GO[17]、KEGG[18-19]、NR[20]等数据库进行比对分析，完成基因注释信息预测及功能预测。使用GeneMarkS（Version 4.17）[21]（http：//topaz.gatech.edu/GeneMark/）软件对新测序的基因组进行编码基因预测，分别通 过 RepeatMasker（Version open-4.0.5）软 件[22]、tR NAscan-SE 软 件[23]、IslandPath-DIOMB 软 件[24]和phiSpy软件进行重复序列[25]、非编码RNA、基因岛和前噬菌体预测。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离鉴定

挑取MRS固体培养基中的单菌落，在加入乙醇的液体培养基中37℃培养12 h后，得到乙醇耐受菌株TYF-B5-5，将菌株TYF-B5-5的16S rRNA在NCBI网站进行Blast同源比对，结果显示，菌株TYF-B5-5与已知菌属Bacillussp.相似度最高，最高相似度可达99.80%，在同一属名下相似度最高的种名为licheniformis。

2.2 菌株代谢产物分析及乙醇条件优化

2.2.1 代谢产物分析 由图2-A菌株TYF-B5-5的气相结果中可以看出，菌株TYF-B5-5在以葡萄糖为碳源时，它的主要代谢产物为乙醇；其次是3-羟基-2-丁酮、丙酮等，与其他代谢产物相比，乙醇含量远高出2倍甚至更多，具体产物如表2所示。作为菌株TYF-B5-5的第二大代谢产物3-羟基-2-丁酮，是乙偶姻的化学名称，乙偶姻是一种重要的食用香料，并且在功能材料、医药生产和化学方面具有广泛的应用，用微生物法生产乙偶姻已成为现阶段最受关注的方法。

表2 菌株TYF-B5-5产物GC-MS分析结果

2.2.2 乙醇特性优化 在MRS培养基基础上，只改变其中碳源，用不同种类碳源代替，从图3-a中可以看出，菌株除可利用葡萄糖外，在木质纤维素的利用上也展现出优势，其在以天然玉米秸秆为底物时，乙醇浓度达到5.8 mmol/L；在此基础上，改变发酵温度及pH，如图3-b显示，在温度为45℃时，乙醇产率最大，乙醇浓度达7.1 mmol/L，在改变温度时发现，菌株TYF-B5-5在35～60℃内都可进行生长代谢，说明菌株TYF-B5-5为嗜热菌；并且通过改变pH结果表明（图3-c），当pH值达到7.0时，此时乙醇产率比其他pH值下明显提高，乙醇浓度达8.0 mmol/L。因此，在以秸秆为碳源时，温度45℃、pH值7.0时，乙醇产率最大，乙醇浓度达8.0mmol/L。

2.3 菌株全基因组测序及乙醇代谢通路预测

2.3.1 样品组装结果 菌株TYF-B5-5共有11个scafflods和12个contings，其中，contingN50和contingN90大小分别为 2 063 254、290 635 bp；GC含量为43.56%，总共有4303个基因，平均长度为826bp，包括78个tRNA和15个sRNA（表3）。

表3 菌株TYF-B5-5的基因组统计

2.3.2 基因功能注释 菌株TYF-B5-5在NR、KEGG和COG数据库中得到注释的基因最多，分别为4245、4179、3107个，分别占基因总数的96.32%、94.83%、70.5%；而TCDB数据库中注释到的基因最少，为546个，占基因总数的12.39%（图4）。

NR数据库显示，菌株TYF-B5-5在属水平上与芽孢杆菌属（Bacillussp.）核酸序列相似度最高，为58.08%；在种水平上与芽孢杆菌（Bacillus subtilis）相似度最高，为32.07%。KEGG数据库分析得出，在代谢通路上，萜类和聚酮化合物的代谢最多，668个基因被注释；其次，是碳水化合物代谢（261个）。GO数据库中整体分3类功能注释结果，其中包括46种细分结果，在细胞过程和代谢过程功能表现最高相关性，分别有1 578、1 574个基因。从TCDB数据库一级分类看，基因组的主动转运蛋白及电化学势驱动转运子基因最多，分别为196、202个；从二级分类看，与转运及P-P磷酸化驱动转运蛋白的数目最多，分别为202、178个。

将菌株TYF-B5-5的氨基酸序列在COG数据库中进行比对，得到相应的基因组功能的注释，结果显示（图5），具有通用功能的基因种类最多，为347个；其次是具有转录功能的基因，共322个注释结果。与碳水化合物的运输和代谢相关的基因也展现出优势，314个基因被注释；此外发现，有233个功能未知的基因，还有待今后深入研究。

2.3.3 乙醇代谢通路预测 在KEGG数据结果中，发现PDH（丙酮酸脱氢酶）、ALDH（乙醛脱氢酶）、ADH（乙醇脱氢酶）、PTA（磷酸转乙酰酶）、AK（乙酸激酶）被注释并进行了功能预测。而根据乙醇代谢通路得知（图6），这5种酶为代谢途径中的关键酶，因此，我们推测菌株TYF-B5-5是通过此路径得到代谢产物乙醇，菌株产乙醇特性从分子生物学角度得到证明。

3 结论与讨论

本试验主要针对山西农业大学分子生物学实验室新筛菌株TYF-B5-5进行的一系列研究，根据GC-MS对代谢产物进行分析，结果发现，其主要代谢产物为乙醇，并且具有广泛的底物谱，如木质纤维素等。虽然产乙醇菌属较多，包括芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，但仍有部分属内物种的生理学和产乙醇潜力未得到广泛研究，为了了解菌株TFY-B5-5的更多特性，进行了全基因组测序分析，确定菌株基因组大小为3 984 415 bp，GC含量为43.56%。通过在KEGG数据库相关基因的功能预测，从分子生物学角度证明菌株产乙醇特性。为今后深入探究分解木质纤维素嗜热枯草芽孢杆菌的代谢功能及生物学特性研究提供了参考。

菌株TYF-B5-5可以利用未经处理的玉米秸秆一步发酵生产乙醇，为我国农业资源利用提供了技术方法。我们参考已有的丙酮酸到乙醇的代谢途径，通过基因组注释信息推断出菌株TYF-B5-5的乙醇代谢通路以及旁路基因PTA等的存在，可能是导致乙醇产率下降的重要原因；接下来可通过荧光定量PCR、基因敲除等方法进一步研究相关基因，使菌株得到工业化应用。在GC-MS结果中发现，除乙醇外，产物中有3-羟基-2-丁酮，说明菌株TYFB5-5具有其他应用价值，值得后期深入研究。

吕福英等[27]研究指出，嗜热富集物在pH值为7.5、以麦秆为唯一碳源时，乙醇产量为0.129 g/L（2.8 mmol/L），而本研究菌株TYF-B5-5比其高出2倍多，且是单菌发酵，可能是由于食醋在生产过程中的特殊性，导致菌株TYF-B5-5既耐高温又能利用秸秆为碳源生产乙醇。其还有待于进一步研究。