温湿度对草莓炭疽菌侵染草莓叶片的影响

赵玳琳 何海永 杨学辉

摘要：为探索草莓炭疽病潜伏侵染条件提供理论依据。本研究在离体条件下通过调控室内温湿度对草莓炭疽病的发病情况及侵染特性差异性进行研究。结果表明：温湿度组合处理25℃/85%、20℃/80%、15℃/80%、10℃/80%、15℃/75%、10℃/75%在接种7天后均能发病，处理10℃/70%接种后28天才轻微发病。侵染特性差异性研究表明，处理25℃/85%，接种6h，25%的分生孢子开始萌发;接种12h，附着孢开始形成，形成率为16%，接种48h，叶片开始出现零星病斑;接种7天，叶片组织细孢大量腐烂崩解，病指为39.07。处理10℃/70%，接种1天，2.88%分生孢子开始萌发;直至接种24天，分生孢子萌发率达到100%，附着孢开始形成，形成率为8.83%;接种28天，叶片开始出现零星病斑，病指仅为1.85;接种42天，叶片组织大面积腐烂，形成典型的炭疽病斑。得出处理10℃/70%接近该病害发病的底线温湿度条件，此条件下的潜伏期能够达到28天。

关键词：草莓;草莓炭疽病;温湿度;附着孢;潜伏侵染;病情指数

中图分类号：S4

文献标志码：A

论文编号：cjas19030005

0引言

草莓炭疽病是全世界草莓产区的重要病害，1931年Brooks首次报道了草莓炭疽病的发生[1]。草莓炭疽病是由半知菌亚门真菌粪科菌纲（Sordariomyeete）黑痣菌目（Phyllacholales）黑痣菌科（Phyllachoraceae）刺盘孢菌属（Colletotrichum spp.）真菌侵染所致[2]，病原菌主要包括3种：草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）[1]、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）[3]和尖孢炭疽菌（C.acutatum）[4]。

近年来，草莓炭疽病己成为继灰霉病和白粉病之后制约中国草莓生产的第三大病害，能造成草莓减产25%-30%，严重时80%，影响草莓的产量和品质[5-8]。因此，寻求新的病害防治策略、开发新的病害安全控制体系对该病害的防治显得尤为迫切。

草莓炭疽病病菌是典型的高温高湿型病菌，降雨量越大，田间湿度越高，炭疽病发病率越高，死苗率越高[9]，最适侵染气温为28-32℃、相对湿度在90%以上，在生产田前期的发病期为9-12月，进入1月（低温）后病菌活动受抑制，病原菌常以菌丝体或分生孢子的形式越冬，停止發病，到4周下旬气温上升，当环境条件适宜时，病害病菌开始活动，病害继续发生[10-11]。草莓炭疽菌大多具有潜伏侵染的特性，及带菌种苗并不表现症状，待有利于病原活动的条件出现，病菌就开始生长和扩展，使草莓植株发病[12]。

目前，潜伏侵染的研究多偏重于对潜伏侵染的确定和组织病原学研究[13]，对导致其潜伏侵染的原因和延长潜伏期的方法研究也越来越受到重视，对于草莓炭疽病的潜伏侵染的确定及检测草莓病原菌潜伏的方法主要是杀死植物组织，以促进潜伏侵染的真菌产孢达到检测的目的，如利用除草剂paraquat（百草枯）[14]、酒精[15-17]、低温冷冻法[18]、紫外线（uv）照射法[19]等杀死植物组织促使病原菌产孢。然而，目前对于草莓炭疽病潜伏侵染微环境条件研究还比较缺乏，草莓大田生产上一般用种苗繁殖，种苗上如果有潜伏侵染的存在，往往会引起病原菌的传播，为生产带来巨大的损失。因此，对草莓炭疽菌潜伏侵染的微环境条件进行研究，明确草莓炭疽病发生潜伏侵染的微环境，是避免草莓炭疽病危害的有效措施。本研究在室内调控条件下通过对草莓炭疽病发病微环境以及发病严重条件和发病轻微条件侵染动态过程差异性进行观察研究，以期为探索该病害潜伏侵染微环境条件提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验时间、地点

室内试验于2018年1-5月在贵州省植物保护研究所生防研究室进行。

1.2试验材料

1.2.1供试菌株草莓炭疽病菌（C. fragariae）荧光菌株：LC0220-7GFP，由中国科学院微生物研究所馈赠，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上4℃条件下保存备用。

1.2.2供试草莓品种‘黔莓2号，健康草莓叶片采集于贵州省农业科学院园艺研究所温室大棚，用灭菌剪刀剪取大小均匀、生长周期较一致的健康草莓叶片若干用灭菌水保湿备用。

1.2.3供试培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。去皮马铃薯200g，葡萄糖20g、琼脂15g，蒸馏水1000mL。

1.3试验方法

1.3.1病原菌分生孢子悬浮液制备 将在斜面保存的病原菌转至PDA培养基上，置于28℃光暗交替人工培养箱中活化培养，培养7天后，用灭菌枪头在长菌平板上加入适量无菌水，用灭菌玻璃棒轻轻刮取菌落表面菌丝，之后用4层过滤纸过滤，收集分生孢子悬浮液，在低倍显微镜下镜检，用血球计数板计数，通过离心浓缩或加入无菌水稀释等方法计算配成浓度为106个/ml的分生孢子悬浮液，为提高分生孢子液在叶片上的粘着性，在接种前加入数滴0.1%Tween-20[20]。

1.3.2接种方法将备好的草莓叶片用无菌水洗净，用75%酒精表面消毒，再用无菌水冲洗后整齐放置于铺有湿润吸水纸的塑料盆中，用无菌水湿润后的湿棉花压住叶柄，确保叶片能长时间保持新鲜，用灭菌枪头吸取备好的浓度为1*106个/mL的分生孢子悬浮液（每叶片500μL）接种于草莓叶片上，以喷洒无菌水作为空白对照，接种好后置于不同温湿度处理光暗交替人工培养箱中培养。

1.3.3不同温湿度处理对草莓炭疽菌侵染草莓叶片的影响根据草莓炭疽病的发病规律，及草莓炭疽病1月份病菌活动受抑制，停止发病，直至3-4月，气温上升，出现病状[2-3]。本试验根据3-4月（该病害开始出现症状）温湿度条件对草莓炭疽病发病的微环境条件进行研究，温度的调节梯度为10℃、15℃、20℃和25℃，湿度的调节梯度为70%、75%、80%和85%，将接种好的叶片分别置于7个温湿度组合：温度25℃/湿度85%、温度10℃/湿度80%、温度15℃/湿度80%、温度20℃/湿度80%、温度15℃/湿度75%、温度10℃/湿度75%、温度10℃/湿度70%在12h/12h光暗交替培养条件下培养。每处理重复3次，每重复6片叶片。在接种不同时间点调查其发病状况，调查时间点根据叶片发病情况而定，最后根据发病叶片分级标准计算其病情指数。

发病叶片分级标准：0级，无病;1级，叶片病斑面积20%以下;3级，叶片病斑面积在20%-40%之间;5级，叶片病斑面积在40%-60%之间;7级，叶片病斑面积在60%-80%之间;9级，叶片病斑面积80%以上。

病情指数计算，见公式（1）。

病情指数=∑（叶片发病各级级别×各级叶片数）/调查总叶数×最高分级级别*100…………（l）

1.3.4侵染特性差异性观察通过不同温湿度对草莓炭疽菌侵染草莓叶片的影响实验选取发病较严重和发病缓慢（接种后长时间几乎不发病）的2个处理，按照Sesma等[21]和Morocko-Bicevska等[22]的方法在接种不同时间点取样，取样时间点根据叶片发病情况而定，每个时间点随机取样3片叶片及3个处理，用灭菌刀片在叶片上从横向和纵向切取5-10片薄片，制作成临时水装片，用于荧光显微镜下进行观察和拍照，观察2个处理之间侵染特性的差异性。荧光显微镜设置：Diode/Argon/HeNel-HeNe2激发光，绿色应荧光通过488nm滤镜观察。

1.3.5统计分析采用DPS（7.05版本）软件对数据进行方差分析，并用最小显著差异法（LSD）比较不同处理间的差异显著性（p<0.05）。

2结果与分析

2.1不同温湿度组合对草莓炭疽菌侵染草莓叶片的影响

由表1可知，在接种草莓炭疽菌后的5次调查中，处理25℃/85%、20℃/80%、15℃/80%、10℃/80%、15℃/75%、10℃/75%在接种7天后均能发病，25℃/85%处理发病情况最严重，病指为39.07;处理10℃/75%在室内接种后11天内病害发展极为缓慢，接种11天时病指为8.25，直至接种后28天，病指才达到88.89;处理10℃/70%直至接种后28天才轻微发病，病指仅为1.85，说明室内调控条件下，处理10℃/70%能使病原菌潜伏28天，处理10℃/70%接近草莓炭疽病发病的底线温湿度条件。

2.2不同发病严重度处理之间侵染特性差异性研究

根据不同温湿度组合条件对草莓炭疽菌侵染草莓叶片发病影响的试验结果：选取发病严重的处理25℃/85%和发病接近底线温湿度组合条件的处理10℃/70%做侵染动态过程差异观察，研究两者之间的侵染特性差异性。

结果得到：处理25℃/85%，接种6h，25%的分生孢子开始萌发;接种12h，分生孢子萌发率能够达到100%，附着孢开始形成，形成率为16%;接种24h，附着孢形成率达到70%（见表2）;接种2天，菌丝大量形成并沿着表皮细孢延伸成网络状，叶片开始出现零星病斑;接种6天，叶片组织细孢大量腐烂崩解（见图1）。处理10℃/70%，接种1天后少数分生孢子开始萌发，萌发率仅为2.88%，之后分生孢子继续缓慢萌发;直至接种24天，分生孢子萌发率达到100%，分生孢子开始产生附着孢，附着孢形成率为8.83%;接种28天，附着孢形成率为73.33%（见表3），在寄主叶片上能用肉眼观察到针头状病斑产生;接种42天，叶片组织大面积腐烂，形成典型的炭疽病斑（见图1）。

在离体条件下，处理25℃/85%，接种1天后就能发病，处理10℃/70%，接种28天后才出现发病症状，处理10℃/70%接近该病害发病的底线温湿度条件，此条件下的潜伏期能够达到28天。

3结论与讨论

通过对7个温湿度组合对草莓炭疽病的发病情况进行研究结果得到，在室内调控离体条件下，温湿度组合处理25℃/85%、20℃/80%、15℃/80%、10℃/80%、15℃/75%、10℃/75%在接种7天后均能发病，处理10℃/70%接种后28天才轻微发病。处理25℃/85%，接种6h，分生孢子开始萌发，接种12h，附着孢开始形成，接种2天，叶片开始出现零星病斑，接种6天，叶片组织细孢大量腐烂崩解形成典型炭疽病斑;处理10℃/70%，接种1天分生孢子开始萌发，接种24天，附着孢开始产生，接种28天，在寄主叶片上能观察到针头状病斑，接种42天，叶片组织大面积腐烂，形成典型的炭疽病斑。

病原菌侵入植物组织以后，由于寄主或环境条件的限制，暂时停止生长活动，但仍保持其生命，寄主也不表现症状，这种现象即称为潜伏侵染。潜伏侵染往往发生在不利于病原菌完成生活周期的植物生长期，待有利于病原活动的条件出现，潜伏的病原菌就开始生长和擴展使植物发病[23]。炭疽菌主要有3种潜伏侵染结构：附着孢、侵染钉和菌丝[24]。冯淑芬1983年[25]报道，橡胶炭疽菌以附着孢作为潜伏结构进行潜伏侵染，以保存菌的生存和侵染，不表现症状，当条件适合，附着孢则产生侵入丝侵入叶片组织内部导致寄主1-3天后表现症状。本研究中在叶片出现症状的时候往往会出现大量附着孢，附着孢的出现也许是导致叶片发病的必要条件，如处理25℃/85%，接种24h，附着孢形成率达到70%，接种2天后叶片开始出现零星病斑，处理10℃/70%，接种28天，附着孢形成率为73.33%，此时已经能在叶片上观察到针头状病斑。因此，笔者认为，草莓炭疽病在潜伏侵染期间，其潜伏结构主要是附着孢，此时的附着孢是一种潜伏结构、抗逆结构或存活结构。

炭疽病发病与田间温、湿度相关。冯淑芬1983年[25]报道，橡胶炭疽菌发展的理由首先是湿度，在进行离体接种或大田接种后不保湿培养叶片发病病情指数远远低于保湿培养，分生孢子在有一层水膜的情况下发芽最快，附着孢形成侵入丝的多少与空气中的相对湿度呈正相关。因此，在生产上建议，提倡大棚避雨栽培，保持通风，深沟高畦，降低田间温湿度，防止草莓炭疽病发生，以达到减少病害发生的目的。

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基金项目：贵州省农业科学院专项“贵州木霉菌资源收集、鉴定与多样性分析”（黔农科院院专项（2016）029号）;贵州省科研机构服务企业行动计划项目“贵州五种特色果蔬病虫害绿色防控技术体系服务企业行动计划”（黔科合服企（2015）4012）。

第一作者简介：赵玳琳，女，1987出生，贵州安顺人，助理研究员，硕士，主要从事植物真菌病害的生物防治研究工作。通信地址：550006贵州省贵阳市花溪区金竹镇贵州省农业科学院，E-mail：dlsczhao@sina.com。

通讯作者：杨学辉，女，1966年出生，贵州遵义人，研究员，博士，主要从事植物病害防治研究工作。通信地址：550006贵州省贵阳市花溪区金竹镇贵州省农业科学院，E-miail：yxuehui66@163.com。

收稿日期：2019-03-04，修回日期：2019-07-22。