精索静脉曲张对精子DNA碎片、活力、形态和体外受精结局的影响*

陈 康 吴妙峰 吴 品 苏 斌 周锡环

广东省惠东县人民医院泌尿外科 516300

精索静脉曲张是一种导致男性不育的常见泌尿外科疾病，发病机制为静脉回流受到阻碍或瓣膜失效后血液返流等致使精索内蔓状静脉丛呈现不同程度的扩张与迂曲，进而引发疾病[1]。在男性人群中，精索静脉曲张的发病率通常达15%～20%，在原发性不育男性人群中，精索静脉曲张的发病率通常达35%，在继发性不育男性人群中，发病率高达80%。精子DNA碎片率(DFI)能够反映出DNA的损伤情况，对精子DFI进行检测可有效预测男性人群的精子功能状况[2]。精子形态及精子活力可作为男性生育力评估参数，精子百分率可作为体外受精的预测参数。研究显示，精索静脉曲张能够导致不育男性的精液质量显著下降，并增加精子DNA碎片率，影响患者体外受精结局[3]。鉴于此，本研究旨在探讨精索静脉曲张对精子DNA碎片、活力、形态和体外受精结局的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究选取医院2017年1月—2019年7月收治的60例精索静脉曲张所致的男性不育患者作为观察组，另选取同期的60例健康生育男性作为对照组。观察组：年龄为20～48岁，平均年龄(31.52±5.23)岁；病程为2～18年，平均病程(5.31±1.22)年；位置：左侧30例，右侧22例，双侧8例；临床分度：Ⅰ度18例，Ⅱ度22例，Ⅲ度20例。对照组：年龄为20～49岁，平均年龄(31.54±5.25)岁。本研究经医院伦理委员会批准，且患者签署了知情同意书。两组患者的一般资料比较无差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入、排除标准 (1)纳入标准：①经B超检查后诊断为精索静脉曲张患者；②同意进行研究者；③无外伤及遗传性疾病史者。(2)排除标准：①合并生殖道感染者；②睾丸发育不良者；③合并严重心脑血管疾病者；④存在性功能障碍病史者。

1.3 方法

1.3.1 仪器与试剂：计算机辅助精子分析仪为法国IMV卡苏的IVOSⅡ型号产品，显微镜为常州顶尖量具有限公司的JX6型号产品，恒温水浴箱为北京天地首和科技发展有限公司的HWT-20B型号产品，移液器为四川芬兰百得移液器生产厂家产品。主要使用试剂均来自于德国Merck公司及瑞典Vitrolife公司。

1.3.2 方法：(1)精液的收集与处理：患者应禁欲2～7d，通过手淫的方法对新鲜的精液进行收集，并置于杯内，收集完成后即时放置于37℃的恒温水浴箱，完全液化后进行常规参数检测；采用苏木素—伊红染色进行精子形态学分析。将剩余的精液用于检测精子DNA碎片率。(2)精子染色质扩散实验：①制片。将精液标本与人输卵管培养液进行调配，浓度为5×106/ml；将1%低熔点的琼脂糖融在90℃的水浴箱中，并在37℃恒温箱中放置3min；将50μl的琼脂糖和20μl的已稀释精液进行混合；吸取20μl琼脂糖—精液混合物，并滴至载玻片上，盖上盖玻片。将载玻片放置在4℃冰箱中5min，移走盖玻片，将样本保留待用。②DNA变性。将载玻片浸入至浓度为0.08mol/L的HCl溶液中，时间为8min；取出后再放入至中和裂解液Ⅰ中，时间为15min；放入至中和裂解液Ⅱ中，时间为5 min；放入至TBE缓冲液中，时间为2min；将载玻片放置在70%、90%和100%的乙醇溶液中进行脱水，时间分别为2min，取出后自然晾干待用。③染色。将瑞氏染液和PBS进行1∶1混合，于瑞氏染色10min后使用蒸馏水进行冲洗，自然风干。④结果判断。在明视野显微镜下计数500个精子。(3)控制促排卵及体外受精：从前一次月经周期后的第21天起，将促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)进行皮下注射，达到降调标准时再加用促性腺激素(Gn)对卵泡发育进行诱导，当主导卵泡直径≥18mm时停用，晚上肌注10 000 IU的HCG， 36h后行穿刺取卵术。取卵当日行体外受精，于授精42h及72h对卵裂情况进行观察。

1.4 观察指标判定 精子DNA碎片率(DFI)=[(无光晕精子+小光晕精子+退化精子)/500]×100%；体外受精率=(受精胚胎数/获卵数)×100%；卵裂率=(2PN卵裂数/体外受精数)×100%。依据Fernández标准进行分级：(1)大光晕：晕轮宽度和核心较小直径相近或更大；(2)中光晕：晕轮宽度在大晕圈和小晕圈间；(3)小光晕：晕轮宽度和1/3核心较小直径相似或更小；(4)无光晕精子；(5)退化精子；其中大光晕和中光晕精子为DNA完整精子，小光晕、无光晕及退化精子为DNA损伤精子。

2 结果

2.1 两组精液的部分常规参数对比 与对照组比较，观察组患者的精液量、正常精子形态率、精子浓度、圆形细胞数、前向精子活力均更低，比较具有显著统计学差异(P< 0.05)。见表1。

表1 两组精液部分的常规参数对比[M(P25，P75)]

2.2 两组的精子DNA碎片率对比 与对照组相比，观察组的精子DNA碎片率(DFI)、无光晕、小光晕、中光晕、大光晕、退化精子率均更高，比较具有显著统计学差异(P< 0.05)。见表2。

表2 两组的精子DNA碎片率对比

2.3 两组体外受精率、卵裂率、优质胚胎率对比 与对照组相比，观察组的体外受精率、卵裂率、优质胚胎率均更低，其中体外受精率、卵裂率比较具有显著统计学差异(P< 0.05)，优质胚胎率比较无显著统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 两组体外受精率、卵裂率、优质胚胎率对比

3 讨论

精索静脉曲张是由于精索内的蔓状静脉丛回流受到阻碍或瓣膜失效后引发的血液淤滞现象，致使蔓状静脉丛出现迂曲、伸长及扩张等，导致精索静脉曲张的形成。在男性不育患者中，精索静脉曲张的发生率较高，对男性的生育能力造成了严重的影响，因此越来越受到临床的重视，但临床尚未完全明确关于精索静脉曲张致使男性不育的确切机制[4]。精索静脉曲张和睾丸体积下降具有密切的关系，且精索静脉曲张能够导致男性不育患者睾丸功能下降[5]。精索静脉曲张引发睾丸出现局部缺氧，增强了无氧酵解，将ATP分解成次黄嘌呤，在黄嘌呤氧化酶的作用下生成具有损害性的细胞活性氧族，通过对氧化/还原动态的平衡进行破坏，诱发生精细胞出现凋亡，使精子数量较少，形态发生异常及增加了不成熟的精子数量[6]。过量的精子细胞活性氧能够直接作用于生精细胞，并使DNA链出现断裂，对DNA的完整性造成破坏，损伤生精细胞，引发不育[7]。精子形态异常及精子活率异常等精液质量异常可反映出精子的发育障碍情况。研究显示，精索静脉曲张能够降低前向精子活力率及正常形态精子率，并增加DFI[8]。

本试验研究结果显示出，观察组的精液量、正常精子形态率、精子浓度、圆形细胞数、前向精子活力均明显低于健康男性组，且观察组的精子DNA碎片率、无光晕、小光晕、中光晕、大光晕、退化精子率均明显高于对照组，比较差异显著(P< 0.05)。陶萍的研究结果证实[9]，伴精索静脉曲张的不育患者的射精量、精子密度、前向活动精子百分率、正常形态精子率均明显下降，与本研究结果基本一致。结果说明：精索静脉曲张使男性不育患者的精子DNA碎片率增加，降低了患者的精子活力、形态率。分析原因可能为：(1)精索静脉曲张患者精液中的精子细胞活性氧过度生成，加之抗氧化的机制发生缺陷，进而易导致精子DNA断裂[10]。由于过量的精子细胞活性氧启动了细胞膜脂质的过氧化，进而生成了大量的脂质过氧化物，对精子质膜进行攻击，致使生精细胞及精子DNA单链、双链发生断裂，破坏了精子DNA的完整性[11]。(2)精索静脉曲张伴男性不育患者的精子线粒体功能低于正常生育的健康男性[12]。精子的活力与精子的线粒体功能密切相关，精子的前向活动百分率直接取决于精子的线粒体功能高度，精子线粒体的数量及功能下降均会导致患者的精子活力下降[13]。

胡少军等的研究中曾报道[14]，伴精索静脉曲张的不育患者的DFI高于正常生育男性；而本研究结果还显示，观察组的体外受精率、卵裂率明显低于同期患者，比较差异显著(P<0.05)；与梁泳娜等的研究报道基本相符合[13]。结果说明：精索静脉曲张降低了患者的体外受精率、卵裂率。分析其可能机制为：精索静脉曲张患者精液中存在过量的精子细胞活性氧，其利用脂质过氧化对精子的DNA完整性产生破坏，精子DNA碎片增加后导致精子的染色质结构变得不稳定，在受精过程中的去浓缩步骤中，染色质纤维蛋白以二硫键的结合方式进行重新排列，虽增加了染色质结构稳定性，但对精卵结合时精子染色质原核的形成产生影响，进而影响患者的体外受精，导致体外受精率及卵裂率降低[15]。

综上所述，精索静脉曲张可增加男性不育患者的精子DNA碎片率，降低体外受精率及卵裂率，同时下降了精子的活力、形态率，影响男性不育患者的受精结局。