冠状动脉粥样硬化新生滋养血管节段异质性及其对钙化出血的作用

蔡 辉 赵施竹

河南省鹤壁煤业公司总医院ICU科，河南省鹤壁市 458000

动脉粥样硬化是一种进行性、血管壁炎症病变，可开始于生命早期，表现为脂质条并进展为突出病变，成年时形成成熟斑块，常含有羟磷灰石钙沉积[1]。粥样硬化斑块组织学范围和钙盐沉积之间有高度相关性[2]。习惯上讲，血管外壁，包括外膜层和滋养血管(VV)，在粥样硬化中起被动作用。 与此相反，有报道认为外膜层在维持血管完整性方面具有重要作用，对于粥样硬化启动和进程及重塑过程亦有影响[3]。实验研究表明外膜的处理，更为特别的是滋养血管，可导致内层改变，类似粥样硬化过程[4]。大动物模型使用微型计算机断层(micro-CT)技术，发现早期粥样硬化与滋养血管新生有关[5]。 其他的机制包括VV通过介导、定位及促进脂质进入和炎症细胞浸润而加快粥样硬化进程，这些都是不稳定斑块的特征[6-7]。 而且，新形成滋养血管的脆弱性有泄漏或破裂的倾向可能介导斑块内出血，是动脉粥样硬化病变发生过程中常发生的重要事件[8]，可发展为斑块破裂，最终导致血栓形成或血管急性闭塞[9-10]。 因而，可以推测VV新生与动脉粥样硬化启动和进展相关，主要是通过细胞增生、游移和斑块内基质生成。本研究的目的是观察冠状动脉节段VV新生与滋养血管破裂并发症和斑块内出血的关系。

1 材料和方法

1.1 材料 50段冠状动脉(取自20支冠状动脉： 左前降支10支、右冠动脉5支、回旋支5支) 取自15例患者尸体解剖。动脉段的组织学分类正常(无粥样斑块，n=12)、非狭窄斑块(轻微或无腔内斑块损害，管腔狭窄<50%，n=18)、非钙化狭窄 (管腔斑块损害，管腔狭窄>50%，斑块钙化面积<50%，n=10)、钙化狭窄斑块 (>50%的管腔狭窄及>50%斑块钙化面积,n=10)。

1.2 Micro-CT分析

1.2.1 标本制备和成像：在尸检过程中，对心脏进行特殊护理，以保护动脉周围的组织，避免损伤外膜。冠状动脉注射 MicrofilTM(Flow Tech,Inc.Carver,MA)，为进行micro-CT 扫描做准备[11]。

1.2.2 分析： 应用 Analyze®software (Biomedical Imaging Resource,Rochester,MN)进行数据分析。对每段以400μm间距切片 35～40层[12]。对每层 micro-CT 切片，根据文献[5,11]方法确定血管壁区域(由外膜的外边界确定)，按照文献[13]确定滋养血管参数。使用连接工具，包括 Analyze®software，对动脉进行3D成像。如图1，该工具能识别各VV血管“树”并追踪其起源。这样可将内部VV(直接起源于主腔)和外部VV(起源于主要冠状动脉分支)加以区分[11]。随后2D成像分析只包括那些实际灌注的VV，即与系统循环连接者，不包括离外膜很近但实际上不是VV的血管。

图1 冠状动脉斑块和VV容积成像
注：三维微CT图像显示的冠状动脉腔为红色，非钙化和钙化斑块区域由箭头表示。

1.3 组织学检查 石蜡包埋后，将动脉横切面切片置于载玻片上，用H&E染色。采用平行组织切片法对微CT图像进行外周边界追踪和VV识别的准确性已经有文献进行了验证[11]。

1.3.1 Von Kossa 钙染色：切片经脱蜡、蒸馏水水化，放入6%硝酸银孵育箱中30min；此后，切片用蒸馏水冲洗，5%硫代硫酸钠孵育5min；切片用自来水冲洗5min，0.1%的核固红染色3min。 用蒸馏水冲洗后， 切片在显微镜下观察(图2)。

图2 钙化狭窄斑块的Micro-CT和组织学注：A:LAD切片的H&E染色标记显微CT与组织学匹配的解剖学标志 B:与同一水平的组织学切片相应的微CT图像，斑块钙化显示黑色强度信号，腔内光亮为 Microfil C:图A放大后 D:图B 切片上游micro-CT E～H:钙化区的不同染色。

1.3.2 血型糖蛋白A染色：脱蜡组织学切片应用抗血型糖蛋白A(CD235a,1∶100;DakoCytomation)识别非钙化和钙化斑块内红细胞碎片(图3)。正常人类骨髓切片用于阳性对照。我们没有在正常的冠状动脉段中观察到红细胞碎片的证据，但是在动脉粥样硬化斑块段中有明显的阳性染色。

图3 不同的动脉粥样硬化期的血型蛋白A染色 注：糖合蛋白A染色与正常(A)、非狭窄(B)和狭窄斑块(C)的苏木(左)对照，并进行相应的放大(右)。

1.3.3 Mallory’s 铁染色：脱蜡与水化后，切片应用亚铁氰化钾/盐酸溶液(50ml 5% 亚铁氰化钾,50ml 5%盐酸)染色10min。将切片用蒸馏水冲洗，核固红染色5min，流动水冲洗2min，放显微镜下观察。

1.3.4 VEGF、TNF-α和eNOS 染色：切片厚4mm。应用抗原回收溶液进行抗原回收。然后用5%的过氧化氢将切片封堵15min。因子Ⅷ抗体(1∶50)内持续30min。 Dako LSAB2工具包用于二级和三级步骤。使用 Dako DAB显色剂。之后，切片置于相应抗体内60min(eNOS, predilute;VEGF,1∶250,TNF-α,1∶50)。Dako LSAB2-AP 试剂盒用于后半部染色，接着用Permanent Red 显色。

1.3.5 血型糖蛋白A和铁评分：血管壁/斑块区的血型糖蛋白A和铁沉积用半定量进行分级(0～4)，分值越高表示百分值越高(1：<25%, 2：>25%但<50%,3：>50%但<75%,4：>75%)。

1.4 统计学方法 连续变量数值以平均值 ± 标准差表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey-Kramer事后检验(Tukey-Kramer post hoc test)，并对多项比较进行校正，以确定各组间的统计差异。个体组间比较采用非配对学生t检验。 统计显著性接受值为P<0.05。

2 结果

2.1 患者与动脉段的特征 临床资料见表1。死亡原因：创伤8例，感染6例，自杀1例。

表1 15例患者特征

注：1mmHg=0.133kPa。

2.2 Micro-CT 资料 非狭窄和非钙化狭窄斑块VV空间密度显著高于正常和钙化狭窄斑块段(表2)。钙化斑块段 VV密度与正常段相似。与正常斑块和钙化斑块段比，这些数据也可理解为非狭窄和非钙化斑块中VV血管面积分数和VV内皮表面分数显著高于正常斑块和钙化斑块段。 将血管壁内所有VV内皮表面加起来，接近45%～67%钙化主腔内皮表面通过非狭窄和非钙化狭窄斑块血管壁上的VV，显著高于正常段的17%。虽然，钙化狭窄斑块段与正常段比，VV密度和分数无明显差异， 在32%的情况下，钙化斑块通过VV获得的内皮交换表面仍明显多于正常血管壁(表2)。与所有其他节段相比，非钙化性狭窄斑块节段的外/内VV比值明显高于其他节段，与正常节段比，非狭窄斑块的比例较高。

表2 Micro-CT和组织学分析

注：*与正常比较，P<0.01；#与正常比较，P<0.001；A与非狭窄斑块比较，P=0.001；B与钙化狭窄斑块比较，P<0.05；C与钙化狭窄斑块比较，P<0.01；D与钙化狭窄斑块比较，P<0.001。

2.3 组织学 van Kossa(钙沉积),Mallory’s(铁、含铁血黄素) 和 血型糖蛋白A染色(红细胞碎片)可识别斑块内出血，这些出血可能是通过非钙化和钙化斑块的滋养血管破裂(图2和图3)。有趣的是，斑块钙化与铁和血型糖蛋白A染色的关系提示复发斑块内出血与斑块钙化有关联(图2)。VV密度与钙化面积负相关(r=0.42,P<0.001,图4)。

VV的进一步表征显示内皮一氧化氮合酶(eNOS)染色，炎症标记物为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)而不是血管内皮生长因子(VEGF,图4)。不同斑块类型之间上述染色无显著差异，除了病变冠状动脉段内VV TNF-α染色趋于更高的阳性外。

2.4 血型糖蛋白A和铁评分 如图3和表2，非钙化狭窄斑块段和非狭窄段比正常段和钙化斑块段血型糖蛋白A分值高。 VV密度和铁评分与VV密度和血型糖蛋白A评分的 Kendall-Tau-brank 相关系数分别为 0.65 (P<0.01) 和0.58 (P<0.01)。

注：为了进一步描述冠状VV的特征，图A：VV 的H&E染色，图B：eNOS染色，图C：TNF-α，图D：VEGF。虽然 VV内皮细胞表达eNOS和TNF-α，但未见 VEGF表达。

3 讨论

本研究显示不同阶段粥样硬化人体冠状动脉的滋养血管分布形式有显著差异。非狭窄斑块段动脉滋养血管密度较高，非钙化狭窄斑块段则进一步增加。 总之，非狭窄和狭窄斑块新生滋养血管与斑块内出血的组织学标志相关。不过，一旦斑块明显钙化，VV密度显著减少与正常段无差异水平。 事实上，VV密度和钙化动脉段钙化面积负相关。可是，与正常段相比，钙化斑块段具有较高的血型糖蛋白 A和铁评分，表明过去的斑块内出血。 因此，本研究进一步支持外膜新生滋养血管和动脉粥样硬化进展和并发症之间有关联。

动脉粥样硬化过程在血管树表面分布具有异质性，正如观察尸体解剖和冠状动脉造影T及血管内超声检查一样[14]。 这种不均匀表达的机理可以部分地用分岔区和曲线区不同的剪应力来解释[15]。然而，血流动力学机制可能不能完全解释斑块在动脉段内甚至在同一横截面上分布的异质性。因此， 确定斑块启动和进展及钙化的共同因素就显得尤为重要，这样可以准确评价斑块负担， 修改疾病的自然历史。应用 micro-CT，已经证明人体和猪循环，不同血管床的外膜滋养血管密度不均质性，与动脉粥样硬化敏感性相关[11-12]。另外，研究发现高胆固醇猪冠状动脉比正常猪的VV密度增加，提示外膜滋养血管在早期动脉粥样硬化重塑过程中起重要作用，这些可能发生于血管功能改变和斑块形成之前。

轻微动脉粥样硬化血管外膜呈现VV增生，结果增加VV数量和密度。根据3D分析，VV新生血管在外部VV水平明显，动脉粥样硬化过程中外部VV和内部VV的比例<1，虽然文献报道内部VV生长受新内膜形成刺激，可能是由于组织对氧气的需求增加[9]。这种外膜重构在明显斑块内进一步增加。虽然新生的VV可作为对抗血管壁缺血的补偿机制，广泛VV网可能作为巨噬细胞和炎症因子进一步进入的管道，可能潜在地促进炎症和斑块形成过程。事实是，血管生成抑制降低斑块内和滋养血管周围巨噬细胞。

应用免疫组织化学对VV进一步观察，显示所有斑块类型的eNOS表达、特别是病变段的TNF-α增加，研究未观察到VEGF表达, 可能受到样本年龄和加工方法影响。伴随动脉粥样硬化的新血管形成过程，致使许多新血管形成，从而增加斑块内出血的可能性。 新生微血管的弯曲和脆弱也促进了这一过程。斑块内出血与坏死核大小和冠状动脉斑块不稳定性增加相关[6]。然而，最终斑块破裂之前，血液产物在斑块间质内沉积可能对进一步刺激炎症过程有作用，其次是组织和纤维化，最终导致钙沉积。

冠状动脉钙化是动脉粥样硬化的病理特征，与斑块负担相关，与阻塞的程度无关。识别和量化动脉钙化是预测心血管风险的可靠方法，特别是调整年龄和性别时的钙化评分。 动脉钙化开始于动脉粥样硬化早期阶段，代表矿化和羟基磷灰石晶体沉积的活性过程[2]。 此外，近期研究表明微钙化与斑块易损及正向重塑相关[5]。然而，钙化过程机制和起源，是否为损伤即炎症的一部分，或是涉及包括成骨内皮祖细胞修复过程的一部分[6]，仍然有待研究。