GLP-1对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏脂肪变性的影响

李丹丹，刘扬，韩家凯，高威，于彤，庞妩燕

(河南大学淮河医院 内分泌科，河南 开封 475000)

随着人口老龄化、酒精滥用、肥胖症在全球流行趋势逐日加重，脂肪性肝病已逐渐替代病毒性肝炎成为终末期肝病的重要病因。非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)根据疾病进展的不同阶段分为非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝纤维化和肝硬化[1]。肝脏脂肪变性是NAFLD的早期阶段，若不加干预，可进展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化，甚至诱发肝细胞癌[2]。NAFLD发病机制目前认为主要是脂肪组织的胰岛素抵抗，诱发氧化应激及炎症反应，进而导致组织损伤[3]，因此也被认为是代谢综合征的一部分[4]。胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)由肠道L细胞分泌，是目前已知作用最强的肠促胰岛素分泌肽。动物和人体实验均发现GLP-1能够显著改善脂肪细胞的胰岛素敏感性，且在降低血糖同时改善血脂代谢。本课题从动物实验入手，研究和分析GLP-1对NAFLD的治疗效果。

1 资料与方法

1.1 实验动物雄性约4周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠150只，体质量为(140±10)g，购自河南大学实验动物中心。在适应性喂养2周后随机分为空白对照组(control group，CON组)，模型对照组(high-fat diet，HFD组)和GLP-1低、中、高剂量治疗组(GLP-1 low、middle、high dose，GLD组、GMD组、GHD组)，每组30只。每天12 h灯光照射，室内温度控制23～25 ℃，湿度40%～50%。对所有动物的饲养及实验处理均遵照河南大学实验动物伦理委员会的章程及规定执行。

1.2 动物模型的建立及分组对CON组全程喂食普通饲料，给予HFD组与GLP-1组高脂溶液(普通饲料88%、猪油10%、胆固醇2%)灌胃12周，促使NAFLD模型的形成。造模成功后，分别给予GLD组、GMD组、GHD组GLP-1(丹麦诺和诺德公司)0.1、0.2、0.4 mg·kg-1·d-1。

1.3 标本的采集及处理每周准确称大鼠体质量，分别于治疗第4周和第8周禁食12 h后予水合氯醛麻醉后用注射器心脏尖端取血，离心后取上清液，冻存于-80 ℃冰箱内。计算治疗前后各组大鼠体质量变化情况及肝指数(肝重占总体质量的百分比)。

1.4 血和肝脏生物化学指标的测定监测CON组和HFD、GLD、GMD、GHD组大鼠血清胆红素、蛋白、肝功能、血脂、空腹血浆葡萄糖(fasting blood glucose，FBG)、空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)等变化情况。测定总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、总胆固醇(total chloesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholestero，LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholestero，HDL-C)、FBG的方法为氧化酶法，检测FINS、直接胆红素(direct bilirubin，DBIL)、间接胆红素(indirect bilirubin，IBIL)、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase，AST)、谷丙转氨酶(glutamate transaminase，ALT)的方法为酶联免疫法。由公式(FBG×FINS/22.5)计算胰岛素抵抗指数(Homa insulin resistance index，HOMA-IR)。每只大鼠取相同部位肝组织50 mg，应用氯仿/甲醇制备肝组织匀浆并提取脂质，采用GPO-PAP法测定肝脏TC、TG水平。

2 结果

2.1 一般情况干预过程中CON组活动度好，饮食正常，皮毛整洁。HFD组活动减少，饮食增多，毛发凌乱黄腻。GLP-1干预组大鼠的一般情况与CON组相似。

2.2 大鼠体质量和肝指数治疗开始时各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗8周后GLD组与HFD组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；GMD组、GHD组与HFD组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。与CON组相比，HFD组肝指数明显升高。治疗4周后GLD、GMD、GHD组较HFD组有一定的改善，但除GHD组外，其他3组差异无统计学意义(P>0.05)；治疗8周后3个治疗组相较于HFD组降低(P<0.05)。见表1。

2.3 血清学代谢指标治疗4周后，GLD、GMD、GHD组DBIL、IBIL以及CHO、TG、LDL-C、AST、ALT相较于HFD组下降，差异有统计学意义(P<0.05)，治疗8周后下降更明显(P<0.05)；治疗4、8周后GLD、GMD、GHD组HDL-C、TP、ALB较HFD组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。GLD、GMD、GHD 3组间比较，GHD组较GLD组变化更明显(P<0.05)。见表2、3。

表1 各组大鼠处死时体质量及肝指数比较

注：与HFD组比较，aP<0.05。

表2 治疗4周后各组大鼠血清学指标比较

注：与HFD组比较，aP<0.05；与GLD组比较，bP<0.05；DBIL—直接胆红素；IBIL—间接胆红素；TC—总胆固醇；TG—甘油三酯；LDL-C—低密度脂蛋白；HDL-C—高密度脂蛋白；AST—谷草转氨酶；ALT—谷丙转氨酶；TP—总蛋白；ALB—白蛋白。

表3 治疗8周后各组大鼠血清学指标比较

注：与HFD组比较，aP<0.05；与GLD组比较，bP<0.05；DBIL—直接胆红素；IBIL—间接胆红素；TC—总胆固醇；TG—甘油三酯；LDL-C—低密度脂蛋白；HDL-C—高密度脂蛋白；AST—谷草转氨酶；ALT—谷丙转氨酶；TP—总蛋白；ALB—白蛋白。

2.4 肝脏氧化和抗氧化能力高脂饮食后HFD组NAFLD大鼠模型肝匀浆丙二醛(malondialdehyde，MDA)明显升高，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)明显降低。治疗4周后，GLD、GMD、GHD与HFD组相比，各指标差异有统计学意义(P<0.05)。治疗8周后，各项指标进一步接近于CON组，与HFD组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；GHD组变化更明显，且与GLD组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 治疗4、8周后各组大鼠肝脏氧化和抗氧化能力比较

注：与CON组比较，aP<0.05；与治疗4周后HFD组比较，bP<0.05；与治疗8周后HFD组比较，cP<0.05；与治疗8周后GLD组比较，dP<0.05；GSH—谷胱甘肽；SOD—超氧化物歧化酶；MDA—丙二醛。

2.5 HOMA-IR高脂饮食后HFD组NAFLD大鼠HOMA-IR明显升高，治疗4周后，GLD、GMD、GHD组与HFD组相比改善明显，差异有统计学意义(P<0.05)。3个治疗组呈现出逐步降低的趋势，GHD组降低最明显，与GLD组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗8周后，改善趋势与治疗4周后一致，但较治疗4周后有进一步的降低。见表5。

表5 治疗4、8周后各组大鼠HOMA-IR比较

注：与HFD组比较，aP<0.05；HOMA-IR—胰岛素抵抗指数。

3 讨论

在大多数发达国家中，NAFLD已经成为一种最为常见的肝病。肝脏在糖脂代谢中起关键作用，因此，NAFLD是许多代谢性疾病的风险因素，如2型糖尿病、高脂血症、高胰岛素血症及动脉粥样硬化等。目前，NAFLD和2型糖尿病已经成为严重的全球公共卫生问题[5]。NAFLD在普通成年人中的发生率为10%～24%，在肥胖和2型糖尿病人群中发病率高达58%～74%和49%～62%。NASH患者2型糖尿病的发病率超过50%[6]。糖尿病是一个强大且独立的NAFLD危险因素，二者互为条件加速恶化，有致死的风险[7]。另外非酒精性肝炎可通过释放炎性介质、血栓形成物及促氧化物质以及通过NAFLD对胰岛素抵抗及动脉粥样硬化的促进作用，促进心脑血管并发症的发生。越来越多的证据表明，NAFLD的临床负担并不局限于肝脏相关疾病，大多数NAFLD患者的首要死亡原因是心血管疾病[7]。

关于NAFLD的具体发病机制尚不明确，以前主要观点是“二次打击”假说[2,8]：代谢失衡和氧化应激。目前，“双重打击”学说替代“二次打击”学说成为一种更加科学的解释[9-10]：多种因素共同作用于易感个体最终导致NAFLD的发生。这些因素包括胰岛素抵抗、脂肪组织分泌的激素、营养因子、肠道微生物群以及遗传和表观遗传因子，其共同作用会改变肝细胞脂肪含量并影响肝脏炎症环境，从而通过异质性肝细胞损伤途径导致慢性肝脏炎症的发生，并可能发展为肝细胞坏死，肝星状细胞的活化和纤维基质的沉积。胰岛素抵抗是NAFLD的一个基本特征，也是促进该病进展的重要机制。研究证实，胰岛素抵抗与肝细胞内甘油三酯的异常积累紧密相关[11]。脂肪酸主要来源于脂肪组织内的脂肪分解、饮食摄入和从头合成，在肝脏中，游离脂肪酸可以重新酯化为甘油三酯，进行β-氧化或作为极低密度脂蛋白排泄，胰岛素抵抗会使胰岛素抑制肝糖输出的能力下降，导致游离脂肪酸向肝脏的通量增加以及甘油三酯的产生增加，从而形成NAFLD。在高胰岛素血症中，SREBP-1c的上调导致糖异生基因的过度表达，导致脂质积聚到肝脏中，从而形成NAFLD。鉴于此，NAFLD防治指南(2018更新版)提出：鉴于NAFLD是肥胖和代谢综合征累及肝脏的表现，大多数患者肝组织学改变处于单纯性脂肪肝阶段，治疗NAFLD的首要目标为减肥和改善胰岛素抵抗，预防和治疗代谢综合征、2型糖尿病及其相关并发症，从而减轻疾病负担，改善患者的生活质量并延长寿命[12]。

GLP-1作为一种葡萄糖依赖性的肠促胰素，食物刺激后由小肠L细胞分泌入血，主要作用于胰腺β细胞，葡萄糖依赖性地刺激胰岛素分泌，抑制α细胞分泌胰高血糖素，抑制食欲以及胃排空，促进胰岛β细胞增殖，抑制其凋亡[13-14]。还有研究显示，GLP-1上调脂肪细胞表面胰岛素受体及胞内胰岛素底物的数量，促进葡萄糖转运子4的表达，进而改善由肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)介导的胰岛素抵抗。另外，GLP-1能够通过降低脂肪细胞内巨噬细胞的浸润，直接抑制炎症信号通路，从而改善胰岛素抵抗，进而对NAFLD起到明显的改善作用[15]。本实验通过高脂饲料喂养SD大鼠成功建立NAFLD模型，HFD组肝脏质量与大鼠体质量百分比第8周时高达(3.11±0.52)%，超过CON组的(2.38±0.24)%。这表明脂肪颗粒已经大量附着在肝细胞。该模型具有NAFLD的典型病理特征，如肝细胞肿胀，体积增大，广泛的大细胞性脂肪变性，胞质内大小不等的脂滴空泡，汇管区有炎症细胞浸润。血清学指标ALT、AST、TBIL、DBIL显著增高。另外，高脂饮食导致肝脏脂质代谢发生障碍，血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，TP和ALB水平升高。GLP-1干预治疗后，大鼠肝脏的脂肪变性得以改善，肝脏所占大鼠体质量百分比与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。这表明GLP-1可明显减少NAFLD肝脏中沉积的脂肪颗粒，起到保护肝脏的作用。大鼠体质量、肝指数及上述血清学指标均有显著改善，这提示GLP-1能显著改善NAFLD脂质代谢紊乱。

氧化应激、脂质过氧化和炎症反应是NAFLD发病中的又一次打击。发生NAFLD时，肝细胞中过剩的游离脂肪酸发生脂质过氧化，产生大量的活性氧簇，一方面促使TNF-α生成，抑制线粒体呼吸，诱发并加重胰岛素抵抗；另一方面活化转化生长因子-β1、转录因子等多种细胞因子，进一步加重肝脂肪变性、坏死及纤维组织生成。MDA是自由基作用于脂质发生过氧化反应的氧化终产物，MDA的量可间接反映细胞损伤的程度。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除自由基的首要物质。GSH结构中含有一个活泼的巯基，易被氧化脱氢[16]。本实验也显示，在NAFLD大鼠模型的血浆中，氧化因子MDA升高，抗氧化指标(SOD、GSH)降低(P<0.05)。GLP-1治疗8周后，上述指标明显改善。这提示在NAFLD中，GLP-1可通过减轻炎症反应和提高抗氧化能力改善肝功能。

综上所述，GLP-1可以改善NAFLD大鼠肝功能，降低肝脏脂肪含量，改善肝脏抗氧化能力和胰岛素抵抗，对NAFLD有治疗作用。