大蒜对纳米金引起蚕豆根尖细胞微核拮抗作用的研究

莫金钢 张硕 李海峰 宋凯

摘   要：为了研究大蒜提取液拮抗纳米金对蚕豆根尖细胞的遗传毒性效应，以100 μg/mL纳米金溶液对蚕豆根尖进行染毒处理，分别以浓度为0～1 g/mL的大蒜提取液作为拮抗效应物。利用蚕豆根尖细胞微核检测技术，研究不同浓度大蒜对纳米金处理下蚕豆根尖细胞有丝分裂行为的影响。试验结果表明，纳米金具有一定的遗传毒性，且随着大蒜提取液浓度的不断增加，蚕豆根尖细胞有丝分裂指数、微核率和染色体畸变率均呈现显著减少的趋势（P<0.05），表明大蒜提取液对纳米金引起的蚕豆根尖细胞毒害作用具有一定的拮抗作用，且最适拮抗浓度为0.25 g/mL。同时，试验结果还表明，高浓度的大蒜提取液对蚕豆根尖细胞的有丝分裂具有一定的抑制作用。

关键词：大蒜;纳米金;蚕豆根尖细胞微核;拮抗作用

纳米材料是指在材料的三维立体结构中，任何一维达到纳米级的尺寸（1～100 nm）或由它们组成的物质，其大小介于原子簇与宏观物体的尺寸之间。由于纳米材料具有化学活性高、吸附能力强等独特的理化特性，已作为一种新兴的材料广泛应用于人们生活的各个领域[1]，因此，纳米材料在生产、运输、使用和回收处理等环节被有意或无意地释放到环境中。研究表明，纳米材料可与植物组织相互作用产生生物毒性[2]。

纳米金是利用物理、化学或生物技术合成的金的超微颗粒，因其具有较高的电子密度、良好的生物相容性、优异的催化作用和独特的光学性质，而被广泛应用于生物医学[3]、免疫检测[4]等多个领域。然而，众多研究表明，纳米金具有一定的生物毒性效应，可诱导细胞程序性死亡。

蚕豆根尖细胞微核试验是一种具有代表性的体外遗传毒性检测方法，早在1986年就已被我国环境保护总局编入《生物监测技术规范》（水环境部分），已在全国水质监测中推广应用。

本研究以纳米金为诱变剂，利用蚕豆根尖细胞微核检测技术检测不同浓度大蒜提取液对纳米金处理下蚕豆根尖细胞有丝分裂行为的影响，为纳米金毒性效应研究提供试验依据。

1   材料与方法

1.1   试验材料与试剂

纳米金（长春师范大学生命科学学院生态学实验室提供，浓度为400 μg/mL）。大蒜和蚕豆均选用市售2018年新种优质大蒜和青皮蚕豆;盐酸、乙醇、改良苯酚品红染液等试剂均为国产分析纯或生化试剂。

1.2   试验方法

1.2.1   纳米金的制备

采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备纳米金颗粒溶液。取48 mL去离子水和1%氯金酸溶液2 mL置于烧杯中，搅拌并加热至沸腾，加入5%柠檬酸三钠溶液1 mL，快速搅拌至溶液变为稳定的酒红色，得浓度为400 μg/mL的纳米金溶液。

1.2.2   大蒜提取液的制备

准确称量大蒜160 g，加入去离子水80 mL。用组织捣碎机将大蒜充分捣碎得到大蒜粗提取液，经抽滤后得到浓度为2 g/mL的大蒜提取液。

1.2.3   蚕豆根尖细胞微核试验

参见莫金钢等的方法稍作改进。蒸馏水浸泡青皮蚕豆后催根，待蚕豆根尖长到1.5 cm 左右时开始处理，试验组共分5个处理组，蚕豆根尖细胞微核诱变剂均为100 μg/mL纳米金溶液，大蒜提取液浓度分别为0 g/mL、0.05 g/mL、0.25 g/mL、0.5 g/mL、1 g/mL，设3次重复。各组处理24 h后转移至去离子水中恢复培养24 h。剪取1.5 cm 左右的蚕豆根尖，并用新配制的卡诺固定液固定24 h后转移至70%乙醇溶液中保存。镜检时采用6 mol/L 的盐酸溶液室温水解10 min，改良苯酚品红染液染色15 min，常规压片后光学显微镜下镜检，每个根尖观察不少于1 000个细胞。

1.3   数据统计与分析

采用Excel 2007进行数据统计和作图，SPSS 13.0进行数据分析。并根据下式计算平均有丝分裂指数、微核率及染色体畸变率。

有丝分裂指数（%）=（分裂期细胞数 / 观察的细胞总数）×100

微核率（‰） = （含有微核的细胞数/观察的细胞总数）×1 000

染色体畸变率（‰） = （含有畸变染色体的细胞数/观察的细胞总数）×1 000。

2   结果与分析

相关结果见图1～图3。

2.1   大蒜拮抗下纳米金对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响

由图1可以看出，随着大蒜提取液浓度的不断升高，蚕豆根尖细胞有丝分裂指数呈现逐渐下降的趋势，各处理组有丝分裂指數均显著低于对照组（P<0.05）。表明随着大蒜提取液浓度的升高，蚕豆根尖细胞有丝分裂受到的抑制作用不断加强。当大蒜提取液浓度高于0.05 g/mL时，处理组间未达到显著性差异（P>0.05）。

2.2   大蒜拮抗对纳米金引起蚕豆根尖细胞微核率的影响

由图2可以看出，随着大蒜提取液浓度的升高，蚕豆根尖细胞微核率呈现先下降再升高然后再下降的趋势，且加入大蒜提取液处理组的微核率均显著低于未加入大蒜提取液的处理组（P<0.05），且当大蒜提取液浓度为0.25 mg/L时，蚕豆根尖细胞微核率的值较低。

2.3   大蒜拮抗对纳米金引起蚕豆根尖细胞染色体畸变率的影响

由图3可以看出，随着大蒜提取液浓度的升高，蚕豆根尖细胞染色体畸变率呈现逐渐下降的趋势，且加入大蒜提取液处理组的染色体畸变率均显著低于未加入大蒜提取液的金纳米溶液处理组（P<0.05），且当大蒜提取液浓度高于0.05 g/mL 时，处理组间未达到显著性差异（P>0.05）。

由此可以看出，随着大蒜提取液浓度的升高，会导致纳米金引发的蚕豆根尖细胞染色体的畸变率逐渐下降，表明大蒜对纳米金的遗传毒性具有拮抗作用。

3   结论

当纳米金溶液的浓度达到100 μg/mL时，具有很强的生物毒性，可以破坏细胞的遗传物质，使细胞产生微核，并且可以使大蒜根尖细胞分裂异常，所以在纳米金的生产、运输、使用或回收的过程中，应该严格控制纳米金向环境中的排放量。

大蒜对纳米金遗传毒性的拮抗作用十分明显，其最佳拮抗浓度为0.25 g/mL，且大蒜具有抑制蚕豆根尖细胞分裂的作用，大蒜提取液的浓度越高，抑制效果越明显。这可能与大蒜的功能性成分蒜氨酸有关，也可能与大蒜富含硒元素有关，具体机制有待进一步研究。

参考文献：

[ 1 ] 苗令占，王沛芳，侯俊，等.金属纳米材料对不同微生物聚集体的毒性研究进展[J]. 水资源保护，2019，35（1）：73-78.

[ 2 ] 施夏明，高超，乔宁宁，等.纳米金对绿豆种子萌发和幼苗生长的影响及其生理机制[J].生态学杂志，2019，38（4）：945-952.

[ 3 ] Xiaoying Z.Gold Nanoparticles：Recent Advances in theBiomedical Applications[J].Cell Biochemistry and Biophysics，2015，72（3）：771-775.

[ 4 ] 陆晨熠，庄贞静，邱飞.纳米金的药用研究进展[J].中国药学杂志，2017，47（7）：481-485.

基金项目：吉林省教育厅“十三五”科学技术研究规划项目（JJKH20181186KJ）、（JJKH20170657KJ）。

作者简介：莫金钢（1979-），男，湖南常德人，博士，副教授，研究方向为作物生物技术。

通讯作者：宋凯（1979-），男，吉林大安人，博士，副教授，研究方向为生物技术。