化肥减量配施有机液体肥对土壤微生物群落结构多样性的影响

2020-02-25赵亚光张凤华

西南农业学报 2020年11期

桑文，赵亚光，张凤华*

(石河子大学/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子 832003)

【研究意义】大量研究表明，施肥可明显改善土壤理化性质、增加土壤肥力、提高作物产量[1-2]，但长期大量使用无机肥会破坏土壤微生物群落、降低土壤微生物的多样性，导致微生物功能退化，从而土壤质量下降，还会导致农业污染加重[3]。为了降低化肥过度施用带来的负面影响，通常采用有机肥代替部分化肥，已有的研究表明，与单施化肥相比，有机肥与化肥配合施用可以提高土壤有机碳水平[4]、协调土壤碳、氮库的平衡，有利于提高土壤生产力[5]，而有机液体肥料作为一种新型水溶性肥料，与化肥配施，能够活化土壤养分、实现高效管理养分资源，从而达到作物高产和农田环境保护[6]；这种施肥方式也将成为我国今后肥料施用的趋势[7]。【前人研究进展】施肥是对土壤微生物环境稳定性造成人为干扰的最主要因素之一，肥料的施用量、种类都会对土壤微生物的多样性产生影响[8]。土壤微生物是土壤中最活泼的生物体，不仅参与土壤养分转化和释放过程[9-10]，还在土壤生态系统的能量流动、固定肥力等方面发挥着重要作用[11-12]是评价土壤质量的一项重要指标[13]。于冰[14]等研究表明，施用有机肥能够增加微生物多样性；袁红朝[15]也指出化肥配施有机物料能够增加土壤细菌种群多样性和数量。【本研究切入点】目前，国内外研究者在不同类型有机肥对土壤微生物的影响方面开展了大量的研究，而对化肥减量配施有机肥的土壤细菌群落结构及多样性方面的研究较少。【拟解决的关键问题】因此，本研究以不同施肥处理的番茄土壤为研究对象，设置不施用化肥、单施化肥和化肥分别全量、减量10 %、减量20 %配施有机液体肥为处理，采用高通量测序技术对土壤细菌16S r RNA 进行测序，分析施用有机液体肥及适量减少化肥的施用量对土壤理化养分及细菌群落结构和多样性的变化，探究施用有机液体肥及适量减少化肥对土壤微生态环境的影响，为化肥减量配施有机液体肥的施肥方式推广及土壤微环境的改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

本研究位于新疆石河子市石河子大学农试场玻璃温室大棚内，供试土壤属中壤土，施肥处理前 0～20 cm 土壤基础养分含量为pH 8.18，有机质 7.25 g·kg-1，碱解氮58.63 g·kg-1，速效磷 7.70 g·kg-1，速效钾 101.91 g·kg-1。

1.2 试验材料

供试作物为番茄，供试品种为里格尔87-5号，于2018年9月25号播种育苗，2018年10月27号定植，2019年5月17日开始收获，2019年6月15日收获完毕。供试化肥：尿素(含 N 46 %)、磷酸一铵(含 N 10 %，P2O544 %)、硫酸钾(K2O 51 %)；有机液体肥有机质含量为 300 g/L，含N 50 g/L，P2O510 g/L，K2O 10 g/L，pH 4.7。

1.3 试验设计

试验设置5个处理，NF:空白对照(不施肥)；CF:单施化肥；CF100SW (化肥全量配施有机液体肥)；CF90SW(化肥减量10 %配施有机液体肥)；CF80SW(化肥减量20 %配施有机液体肥)。根据番茄需肥特性于番茄苗期施入15 %，盛花期施入25 %，盛果期施入60 %，各处理具体氮、磷、钾养分施用量见表1。

表1 试验处理及施肥用量

各处理重复3次，随机区组排列，共15个小区，小区之间铺设1 m深的隔离膜，小区面积1.6 m×5 m=8 m2，番茄采用覆膜种植，1膜2管2行配置，株距40 cm，行距60 cm，理论株数5.2×104株·hm-2。总灌水量2700 m3·hm-2，灌水8次，随水施肥6次，每个处理均采用单独施肥罐，其他栽培管理措施参照当地大田。

1.4 测试项目及方法

于番茄盛果期进行土壤样品的采集，每个小区取3个点，均匀混合后装入密封袋冷藏带回实验室。

将土壤样品过 2 mm筛,去除结石和植物根部并分成 2 份。一份土壤于室内风干、研磨、过筛后装入自封袋中, 用于土壤理化性质测定；另一部分新鲜土壤，装入无菌塑料袋，置于-80 ℃的冰箱冰箱中存储，用于土壤微生物的 DNA 提取和测序。

1.4.1 土壤理化性质的测定 pH采用电极电位法测定；有机质采用重铬酸钾容量法；碱解氮采用碱解扩散法；速效磷采用碳酸氢钠浸提——钼锑抗比色法；速效钾采用醋酸铵浸提——火焰光度计法[16]。

1.4.2 土壤微生物的测定土壤微生物多样性测定委托北京百迈客生物科技有限公司采用Illumina Hiseq 2500平台对纯化的合并样品进行细菌rRNA基因的高通量测序分析。

1.5 数据处理

土壤微生物数据系统分析由北京百迈客生物科技有限公司进行。SPSS17.0软件进行单因素方差分析及多重比较，数据处理及绘图采用EXCEL.2013 进行。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对土壤基本理化性质的影响

由表2可以看出，各施肥处理较空白对照NF土壤pH均有所降低，CF90SW与NF处理间差异显著，其他处理间差异不显著；土壤有机质表现为CF90SW>CF80SW>CF100SW>CF100>NF，施用有机肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW处理有机质含量较单施化肥CF100分别增高9.62 %、30.41 %、16.62 %，CF90SW含量最高，为13.59 g/kg；土壤碱解氮表现为CF80SW>CF100SW>CF90SW>CF100>NF，施用有机肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW处理碱解氮含量较单施化肥CF100分别增高37.79 %、33.43 %、52.33 %，CF80SW含量最高，为61.13 mg/kg；土壤速效磷和速效钾表现趋势一致，为CF100SW>CF90SW>CF80SW>CF100>NF，CF100SW、CF90SW、CF80SW处理与CF100、NF处理间差异显著，CF100、NF处理间差异不显著。由以上分析可以看出，通过施用有机液体肥能够补充和增加土壤有机质和养分，改善土壤理化性状，提高土壤肥力。

表2 不同施肥处理0～20 cm土壤基本理化性质

2.2 不同施肥处理土壤细菌Alpha多样性分析

Alpha多样性用于分析样品内(Within-community)的微生物群落多样性，Shannon 指数是衡量群落多样性的重要指标，Shannon指数越大说明群落的多样性越高[17]，由表3可知，施用肥料的各处理土壤OTU数、Shannon 指数和Chao指数较空白对照NF均有所增加，说明施肥能够提高土壤细菌群落多样性；其中施用有机液体肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW处理OTU数分别为1919、1574、1361，较单施化肥CF100处理分别增高74.90 %、43.48 %、24.07 %；CF100SW、CF90SW处理Shannon 指数为6.48、6.46，较CF100处理分别增高10.86 %、10.51 %；CF100SW、CF90SW和CF80SW处理的Chao指数为1927.16，1625.12、1446.85，较CF100分别增高49.93 %、26.43 %、12.56 %，说明有机液体肥较常规化肥的施用更有利于提高土壤细菌群落的数量和均匀度，且适量减少化肥的施用CF90SW、CF80SW处理仍能够提高土壤细菌群落多样性。

表3 不同施肥处理土壤细菌群落多样性指数

2.3 不同施肥处理土壤微生物群落组成分析

2.3.1 在门级别的菌落组成分析根据各OTU中代表序列的物种注释结果，选取各处理0～20 cm土壤样品中细菌在门(Phylum)分类水平上最大丰度排名前 10 的物种。由图1 可知，5 个施肥处理0～20 cm土壤中细菌在门的分类水平上，最大丰度排名前10的种类从大到小依次为: 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria) 、绿弯菌门(Chloroflexi) 、疣微菌门(verrucomicrobia)和patescibacteria。其中变形菌门(Proteobacteria)在施用有机液体肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW处理相对丰度分别为38.52 %、43.06 %、22.50 %，较空白对照NF丰度分别增高20.69 %、25.23 %、4.67 %； CF100SW、CF90SW较单施化肥CF100丰度分别增高12.53 %、17.07 %，CF80SW降低3.49 %； CF100SW、CF90SW拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度减少，与变形菌门(Proteobacteria)呈相反的变化，较NF降低17.08 %、21.05 %，较CF100降低10.80 %、14.76 %，CF80SW较CF100丰度增高8.24 %；厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)变化趋势一致；CF100SW、CF90SW、CF80SW的放线菌门(Actinobacteria)较NF和CF100丰度均有所降低；而CF100SW、CF90SW、CF80SW的酸杆菌门(Acidobacteria)则有所增加，分别为8.92 %、14.02 %、6.05 %，较NF增高4.18 %、9.28 %、1.31 %，CF100SW和CF90SW较CF100增高2.24 %、7.34 %。由以上分析可以看出，施用有机液体肥的CF100SW、CF90SW处理对优势菌门群落结构组成影响较大。

图1 各样本在门水平的细菌相对丰度Fig.1 The relative abundance of bacteria from five samples at the level of phylum

2.3.2 在属级别的菌落组成分析由图2可以看出，在细菌属水平上最大丰度排名前10的有许多免培养的细菌，且施用有机肥的CF100SW和CF90SW处理与其他3个处理差异较大，表现为uncultured-bacterium-f-Muribaculaceae属、Rumiinococcaeceae-UGG-014属、Lachnospiraceae-NK4A136-group属丰度较其他3个处理有所降低；uncultured-bacterium-c-Subgroup-6属、uncultured-bacterium-f-Gemmatimonadaceae属、Nicotiana-otophora属、Haliangium属丰度较其他3个处理有所增高。在NF、CF100、CF80SW处理中uncultured-bacterium-f-Muribaculaceae属丰度最大，分别为21.08 %、14.42 %、22.56 %，其次为Rumiinococcaeceae-UGG-014属，丰度分别为9.17 %、6.65 %、10.12 %；uncultured-bacterium-c-Subgroup-6属和Nicotiana-otophora属为CF100SW、CF90SW处理的主要菌属，丰度分别为4.68 %、7.26 %和7.72 %、2.19 %。由以上分析可以看出，与门水平结果一致，施用有机液体肥的CF100SW、CF90SW处理对菌属群落结构组成影响较大。

图2 各样本在属水平的细菌相对丰度Fig.2 The relative abundance of bacteria from five samples at the level of genus

2.4 不同施肥处理土壤微生物群落结构的相似性分析

基于Beta多样性分析得到的距离0.05的矩阵，对土壤细菌群落进行层次聚类，由图3可知，施肥的4个处理与空白对照NF位于两大支，说明施肥处理与不施肥处理物种组成差异较大，该4个处理中CF100SW和CF90SW处理位于一支，说明该2

图3 不同施肥处理UPGMA聚类树分析Fig.3 Analysis of UPGMA cluster tree by different fertilization treatments

个处理物种组成最相似，其次为CF80SW和CF100。整体来说，施用有机液体肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW的物种组成较为相似，与单施化肥CF100和空白对照NF差异较大。

2.5 微生物群落与环境因子影响之间的关系

通过对土壤微生物群落和环境因子进行RDA分析可以看出，第一主成分轴对细菌群落结构变化的解释率为62.12 %，第二主成分轴对细菌群落结构变化的解释率为22.14 %，总解释率为84.26 %；有机质、速效磷和碱解氮与酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌(Gemmatimonadetes) 和绿弯菌门(Chloroflexi)呈较大的正相关性，与放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes) 和厚壁菌门(Firmicutes) 呈较大的负相关性；pH与拟杆菌门(Bacteroidetes) 和厚壁菌门(Firmicutes)呈正相关与其他菌门呈负相关，说明有机质和养分含量的增加能够促进酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes) 和绿弯菌门(Chloroflexi)这些微生物的生长，而pH的增高则会促进拟杆菌门(Bacteroidetes) 和厚壁菌门(Firmicutes)的生长(图4)。

图4 土壤理化性质与细菌群落组成(门水平)的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) of soil properties and bacterial community composition (at Phylum level)

3 讨论

在本研究中，施用有机液体肥后，较单施化肥处理土壤的速效养分和有机质含量增加，这可能是因为有机液体肥作为一种酸性肥料，其含有的氨基酸态氮和小分子有机酸通过螯合作用和酸溶解作用能够促使土壤氮素转化为更易吸收的矿化态氮[18]以及磷元素形态的转化[19]，提高土壤中氮、磷的有效性，也能改变根际土壤pH值和氧化还原状况[20]。土壤微生物是土壤稳定态养分转变为有效态养分的催化剂，可敏感地反映土壤养分转化速率与驱动力[21-22]。不同施肥处理对细菌群落结构和多样性产生一定影响。施用有机液体肥的土壤细菌群落丰富度和均匀度较单施化肥处理有所增加；与单施化肥CF100相比，施用有机液体肥的CF100SW、CF90SW、CF80SW处理的OTU数量、Shannon 指数和Chao指数均有所增高，这可能是由于有机液体肥的施入，为土壤提供了营养物质，促进微生物的大量繁殖[23-24]，因此提高了土壤中微生物的数量和多样性，且适量减少化肥的施用(CF90SW、CF80SW)仍能提高土壤微生物的数量，陆海飞[25]，Yuan[26]等也发现，有机肥与化肥配施后能显著增大土壤细菌的 Shannon 指数和丰度指数，Shen[27]研究也表明连续两年施加生物有机肥后，土壤中细菌群落的多样性显著提高，这与本研究的结果相一致。

本研究表明，施用有机液体肥对土壤微生物活性及结构影响较大，不同施肥处理土壤细菌组成主要为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)，其次为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria) 等。施用有机液体肥的CF100SW和CF90SW处理的变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度高于空白对照NF和单施化肥CF100，表明施用有机液体肥及适量减少化肥施用量能够为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)的生长提供较好的生长环境，而CF80SW与NF、CF100处理无明显变化，可能是由于过量减少化肥的施用量的原因，说明化肥减量20 %配施有机液体肥处理其土壤微生物环境与单施化肥较一致。赵凤艳[28]等研究表明，施用有机肥可以增加土壤优势菌群变形菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门等一些菌群的生长，变形菌门属于嗜营养菌，它的许多类群与根瘤菌的共生固氮密切相关[29]，酸杆菌门也可参与腐殖质分解的碳循环过程[30]，这些菌群的一些菌属等均具有拮抗、促生作用[31]，在维持土壤生态系统健康中起主导作用[32]。在属分类水平上，施用有机液体肥的CF100SW、CF90SW处理uncultured-bacterium-c-Subgroup-6属、uncultured-bacterium-f-Gemmatimonadaceae(免培养的芽孢杆菌科属)、Nicotiana-otophora属、Haliangium属丰度较空白对照NF、单施化肥CF100、化肥减量20 %的CF80SW处理增高，由于有大量未被培养出的细菌，而这些细菌功能不详，这可能跟试验地的土壤类型有关，也可能与所施用的有机液体肥类型有关。在微生物群落结构相似性的分析中也表明，施用有机液体肥的处理更具有群落的相似性，与空白对照和单施化肥处理差异较大，表明通过施用有机液体肥能够改变土壤细菌菌群的结构[33]；而土壤理化性质也影响着土壤微生物群落的变化[34-35]，在本研究中，碱解氮、有机质和速效磷是影响土壤细菌门丰度的主要因素，酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)与有机质、碱解氮、速效磷呈较大的正相关性，pH与拟杆菌门(Bacteroidetes)呈正相关，与放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)呈负相关；Tóth, Z[36]研究也证实，有机质含量的高低能对土壤细菌群落的结构和组成产生影响；Kim M ，Zhalnina K称pH在 5～9 的范围内，绿弯菌门(Chloroflexi)在土壤中的比例与pH呈显著负相关[37-38]。因此，通过施用有机液体肥能够增加土壤养分、提高土壤细菌群落多样性、影响土壤微生物群落结构、进而能够提高农田生态系统的生产力、有效维持土壤生态功能、保持土壤健康[39]。