不同产地山药药材的含尿囊素量测定研究

吕 航，张全丽，孙向明，3*

(1.哈尔滨商业大学 药学院，药物工程技术研究中心，哈尔滨 150076；2.北京博达绿洲医药科技研究有限公司，北京 101113；3.哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

山药为薯蓣科(Dioscoreaceae)植物薯蓣(Dioscoreaoppositathunb)的干燥根茎，是中医常用的一味健脾补气的良药.2015年版《中华人民共和国药典》一部记载山药具有“补脾养胃，生津益肺，补肾涩精”的功能[1-3]，可用于治疗“脾虚食少，久泻不止，肺虚喘咳，肾虚遗精，带下，尿频，虚热消渴”等症.药用山药分布较广[4]，除少数热带地区外，几乎各地均有栽培[5].山药中含有多糖、尿囊素、皂苷、淀粉等多种有效成分[6-7]，其中尿囊素作为一种尿酸衍生物，具有修复上皮组织[8]、促进伤口愈合，麻醉镇痛等作用[9-10].虽然截止目前，2015年版《中华人民共和国药典》 尚未收录山药相关有效成分的含量测定项，但尿囊素已广泛被研究人员用以评价山药药材质量[11-14].鉴于以上空白，本实验收集了不同产地出产的山药药材，建立高效液相色谱法，旨在为山药质量标准的提升提供有益借鉴.

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪 (Agilent1100)，检测器：1100 series，色谱柱：Thermo C18(5 μm 4.6×250 mm)；UC-101-HTD超声波清洗器 (北京凯维丰科技有限责任公司)； AL104电子天平 (梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；粉碎机(型号：LG-50 浙江省百瑞安百信药机器械厂)；

1.2 试药

液相分析用甲醇、乙腈为色谱纯 (天津益仁达化学试剂厂)，实验用纯化水(高碑店娃哈哈宏振饮用水有限公司).对照品尿囊素 (批号111501-200202).

1.3 药材

山药药材采收于全国各地产区，药材信息见表1.

表1 药材信息

2 测定指标及方法选择

依照高效液相色谱法《中华人民共和国药典》(2015版 四部 0512).

2.1 样品溶液的制备

取尿囊素对照品放至室温，精密称取10 mg，置于10 mL容量瓶中，加水使其充分溶解后，定容至刻度，混合均匀，配成质量浓度为1 mg/mL的对照品储备液.再取1 mL对照品储备液于25 mL的容量瓶，用水定容至刻度，混合均匀，制成40 μg/mL对照品溶液，置于4 ℃避光保存.

取山药粉末(过3号筛)，精密称取0.5 g，置入100 mL三角锥形瓶中，精密加入50 mL 水，称重，超声处理30 min，冷却，称重，补重，取上清作为供试品溶液，过0.45 μm的滤膜，备用.

2.2 色谱条件

色谱柱：Thermo C18(5 μm 4.6×250 mm)；测定波长：224 nm；柱温：30 ℃；流速：0.4 mL/min；流动相为乙腈-水(2∶98).

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察

分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液和空白溶剂5 μL注入高效液相色谱仪测定，绘制液相色谱图，由色谱图提示，在对照品色谱峰相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，流动相在此峰位无吸收，对本品中含尿囊素量的测定无干扰，方法专属性良好.

2.3.2 线性关系考察

取尿囊素对照品9.68 mg置10 mL容量瓶中，加水溶解，定溶至刻线，作为对照品母液，再分别取1 mL对照母液置5、10、25、50、100 mL的容量瓶中，分别加水定溶至刻线，混合均匀，过0.22 μm滤膜于自动进样瓶内，进样量分别为5 μL，观察尿囊素的峰面积和保留时间，并以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线.进行线性回归，得回归方程y= 3 838.1x，线性系数r=0.999 8，结果表明：尿囊素10～1 000 μg/mL范围内呈良好的线性关系.见表2.图1、2.

图1 山药含尿囊素量测定专属性图(从下到上图谱分别为空白溶剂、标准品、山药)

编号质量浓度/(μg·mL-1)进样体积/μL进样量/μg峰面积标曲19.6850.048 450 656标曲219.3650.096 879 225标曲338.7250.193 6156 011标曲496.8050.484 0388 802标曲5193.6050.968 077 9946标曲6968.0054.840 03 706 630

图2 尿囊素标准曲线

2.3.3 精密度试验

取质量浓度为38.72 μg/mL的对照品溶液和供试品溶液在上述色谱条件下各重复进样6次，进样量5 μL，测定峰面积.见表3、4.

表3 对照品试验精密度测定结果

表4 供试品试验精密度测定结果

尿囊素的对照品峰面积RSD为0.72%，供试品的峰面积RSD为0.77%,说明该仪器精密度良好.

2.3.4 重复性试验

按供试品溶液的制备项下方法，制备供试品溶液各6份，各精密吸取5 μL，分别进样分析，测定色谱峰面积，并计算含尿囊素量.见表5.

表5 重复性试验测定结果

以峰面积和供试品质量浓度计算所含尿囊素量，并计算含尿囊素量的RSD值,RSD为1.30%.说明样品重现性达标.

2.3.5 稳定性试验

按供试品溶液的制备项下方法，制备供试品溶液，各精密吸取5 μL，按0、2、4、6、8、10、12 h时间间隔，分别进样分析，测定色谱峰面积.见表6.

表6 稳定性试验结果

供试液制备12 h内测定，峰面积RSD为1.15%，色谱峰面积无明显变化，在此时间内，供试品溶液中待测组分化学性质稳定.

备注:因制备供试品的溶剂为水,样品经12 h后变浑浊,故需要低温保存,不适合常温12 h以上稳定性.

2.3.6 样品测定

取不同来源山药药材粉末，按“2.1项样品溶液”制备样品，按“2.2项色谱条件”进样.经观察结果发现不同产地山药药材的含尿囊素量存在差异，湖北黄冈的佛手山药所含尿囊素量最高，其次为四川的攀枝花山药以及陕西的华山山药.见表7.

表7 样品测定结果

3 讨 论

HPLC法因具有操作简单，结果准确等优点，在近年来的报道中为测定山药含尿囊素量最常用的分析方法[15].在流动相的选择时，本实验考察了甲醇-水(1∶99)、甲醇-水(4∶1)，乙腈-水(2∶98)等条件，因尿囊素本身极性较大，出峰时间较短，发现在甲醇-水(1∶99)的条件下检测洗脱过快，不利于尿囊素的检测.最后选用乙腈-水(2∶98)的条件进行洗脱.经查阅有以1 mL/min的流速进行洗脱的文献记录，但鉴于其极性因素，本实验最终确定流速为0.4 mL/min，这样可以将尿囊素的保留时间大大延长，出峰时间控制在8 min左右.

目前，国内中药市场尚存在无序竞争的混乱局面,由于来源不一、产地不同,掺杂使假,导致药材质量良莠不齐.很多中医药行业的乱象和问题，都与行业未能形成标准化有关.以中药材为例，作为中药行业的核心环节，由于缺乏统一划分标准等因素，中药材一直是不合格产品的重灾区.针对目前中医药行业所面临的信任危机，可以说只要掌握了标准，就掌握了市场的主动权.尿囊素作为山药中含量较高的有效成分，尽快建立及完善其含量测定方法，将有助于山药药材质量标准的提升.