脱细胞鱼皮基质的制备、改性与应用前景

苏东 ，冷凯良，刘小芳，张俊杰

1. 江苏海洋大学海洋生命与水产学院（连云港 222000）；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部极地渔业开发重点实验室（青岛 266071）

脱细胞真皮基质（ADM）是指不同来源的皮肤经脱细胞工艺处理，将皮肤组织中抗原性较强的组分，包括表皮、皮肤附属器（毛囊、皮脂腺、汗腺）、真皮内的血管内皮细胞、成纤维细胞等去除后，所剩余的免疫原性相对较弱的细胞外基质及真皮层的胶原纤维网状结构[1]。目前市场上常见的脱细胞真皮基质一般来源于猪、牛、羊和马，它们的制作工艺和临床应用已趋于完善[2-3]。然而，由于近年来牛海绵状脑病（BSE）和高致病性禽流感（HPAI）等人畜共患病频发，以及宗教信仰等因素，导致猪、牛等哺乳动物的脱细胞基质材料颇受争议。而鱼皮可以较好地规避宗教壁垒，且具有胶原蛋白含量高、抗原性低、生物安全性高和产量丰富等优势[4]。

1 鱼皮的结构基础

1.1 鱼皮的组成

鱼皮一般是由鱼鳞、表皮、真皮及皮下组织构成，可分为鳞面层、表皮层、真皮层和皮下组织层。表皮层中富含表皮细胞，可以分泌角质，真皮层主要由胶原纤维、糖胺聚糖、弹性纤维等组成，还有一些色素细胞、血管和脂肪组织等[5-6]。而哺乳动物的皮肤，如牛或猪皮，一般是由表皮层、真皮层和皮下组织层组成；表皮层中富含角化细胞、基底细胞和色素细胞等；真皮层又分为乳头层和网织层，主要由胶原纤维和弹性纤维组成，包括血管、淋巴管、毛囊、皮脂腺等[7]。

1.2 鱼皮中的胶原蛋白

脱细胞基质材料的主要成分是胶原蛋白，鱼皮的蛋白质含量比鱼体的其他部位高，其胶原蛋白含量最高可占其蛋白质总量的80%以上[8]。Takeshi等[9]研究表明：鲈鱼（Lateolabrax japonicus）皮、骨和鳍中的胶原含量分别为51.4%，40.7%和41.6%（干基）。而常见的哺乳动物皮肤，如猪皮中的蛋白质含量约为33%，胶原蛋白占总蛋白的比率为87.8%左右[10]。猪皮和鱼皮中的胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白，具有由三条α-肽链以右手螺旋形式缠绕成的草绳状三股螺旋结构。在显微镜下观察，胶原由直径2～15 μm的胶原纤维组成，多数成束状结构，胶原束相互交织成网状[11]，这种网状结构有利于细胞的进入和生长。

1.3 鱼皮中的脂肪酸

鱼皮中含有丰富的不饱和脂肪酸，如Ω-3、二十碳五烯酸、花生四烯酸等，能有效抑制炎症发生，减少机体的免疫排斥反应[12]，Sigurjonsson[13]在制作脱细胞鱼皮过程中，去除了鱼鳞和表皮脂肪，保留了真皮层中的脂肪。体外试验表明，脱细胞鱼皮基质表现出良好的生物相容性。而哺乳动物的油脂主要为饱和脂肪酸，并无抗菌、抗炎等生物学功能，一般在脱细胞前处理过程中将其去除。Baldursson等[4]研究发现，在全层皮肤损伤临床应用中，脱细胞鱼皮基质较猪小肠黏膜下层脱细胞基质的愈合速度快，生物相容性好，这可能与鱼皮中的不饱和脂肪酸有关。

2 鱼皮的脱细胞方法

国内外对于脱细胞鱼皮基质的制备方法没有统一的标准，因为鱼皮特殊的物理性质（如变性温度低[14]、网状层结构复杂[15]等）导致常规的哺乳动物皮肤脱细胞方法并不完全适用。Sigurjonsson[13]报道一种用于创伤修复的脱细胞鱼皮基质的制备方法。先去除鱼皮表面的鳞片和表皮脂肪，用PBS浸泡以稳定鱼皮内的三维结构，用十二烷基硫酸钠（SDS）处理去除细胞、Tris-HCl和0.05 μg/L胰蛋白酶裂解精氨酸和赖氨酸C端的多肽键（无脯氨酸连接）[16]，最后将所得的脱细胞鱼皮基质经预冻液处理后冷冻干燥，再经环氧乙烷灭菌[17]。操作过程中全程控制温度为4 ℃，鱼皮经过提前冻融（-70 ℃），更利于脱细胞处理。制得的脱细胞鱼皮基质较好地保留了胶原纤维三维支架结构。

国内学者王园园等[18]以沙鳗（Astroconger myriaster）鱼皮为原材料，去除内侧筋膜、脂肪和多余鱼肉，用生理盐水和超纯水反复冲洗后抗坏血酸处理1 h，利用甲酸使基质溶胀并去除表皮层，用NaCl浸泡去溶胀，-80 ℃反复冻融使细胞裂解。之后用脱氧胆酸钠、SDS和0.2 μg/L胰蛋白酶溶液进一步脱细胞，最后用生理盐水洗涤干净后冻干成型，60Coγ射线辐照灭菌。制得的脱细胞鱼皮基质机械性能较好，较好地脱除了细胞，材料几乎全为胶原纤维，无PAS阳性物质。同时其DNA含量明显低于天然鱼皮和市售口腔修复膜，在动物试验中无致敏反应。

2种制备方法均是利用SDS和胰蛋白酶溶液进行脱细胞处理，SDS可以溶解细胞膜和核膜[19]，而胰蛋白酶主要作用于精氨酸和赖氨酸C端的多肽键[20]，在两者的共同作用下可使细胞有效地裂解并将细胞碎片洗出。在组织的预处理中，可以提前通过反复冻融法破坏细胞，将组织置于低温条件下（-20 ℃～-80 ℃），使细胞内形成冰晶，由于细胞内冰晶的形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起细胞溶胀，从而使细胞结构破碎[21]。

需要注意的是，脱细胞基质的主要成分是胶原蛋白，在未变性条件下，胶原蛋白对胰蛋白酶具有抗性，但是当胶原蛋白发生变性后，其原有的三螺旋结构会解旋，α-链易被蛋白酶酶解成肽段，胶原纤维的网状结构会被破坏[22]。因此在脱细胞过程中，应该严格控制环境温度和洗脱剂处理时间等因素。

3 脱细胞鱼皮基质的改性

与哺乳动物相比，脱细胞鱼皮基质的热稳定性较差，水产胶原蛋白的变性温度普遍低于哺乳动物胶原蛋白[23]，这与它们自身的温度及所处生活环境有着密切关系[24]，在正常人体体温条件下（37 ℃）也会发生变性，因此，必须通过技术手段提高脱细胞鱼皮基质的稳定性。常用方法是交联法，包括化学法、物理法和酶法交联。

3.1 化学法交联

化学法交联是依靠化学交联剂与胶原的相互作用，在胶原纤维间和胶原纤维内引入外源性交联[25]。常用的化学交联剂包括戊二醛（GTA）、碳化二亚胺（EDAC）、叠氮二苯基磷（DPPA）等。需要注意的是，化学法交联虽然能够提高基质的稳定性，但是必须考虑交联剂在人体内的降解速率，即交联剂的选择、交联的时间和交联剂的浓度问题。近年来，有学者利用京尼平（Genipin）与胶原[26]、明胶、壳聚糖等交联制作生物材料，交联效果较好；京尼平的毒性远低于戊二醛和其他常用的化学交联剂。此外，某些天然交联剂因为其毒性较低、交联效果好等特点得到广泛研究。Tan等[27]利用双醛羧甲基纤维素钠（DCMC）与胶原交联制作胶原海绵，胶原的热稳定性和机械性能明显提高。

3.2 物理法交联

物理法如电离辐射、紫外线照射等，X射线能够在相邻胶原纤维之间产生热稳定的分子间交联[28]，紫外线能与核黄素等光敏剂结合，在胶原纤维内和胶原纤维间形成羰基共价键[29]。与化学法交联相比，物理法交联能够避免引入有毒化学物质，但是过程中温度的升高会导致胶原蛋白的三螺旋结构被破坏，从而影响脱细胞鱼皮基质的三维结构。Davidenko等[30]利用紫外线对牛胶原进行交联，过程中引入葡萄糖来提高交联效果，同时防止胶原蛋白三螺旋结构解旋，交联后的胶原蛋白三维结构得到较好保留，稳定性也有显著提高。

3.3 酶法交联

酶法交联一般是利用酶的特异性催化，如赖氨酸氧化酶能够特异性地催化胶原分子N端和C端末端肽区的赖氨酸/羟赖氨酸修饰成α-氨基己二酸半醛。这些新形成的醛与未修饰的赖氨酸或羟赖氨酸残基缩合形成交联[31]。常用的酶还包括谷氨酰胺转氨酶，它通过催化酰基转移反应，谷氨酰胺残基的g-甲酰胺基团作为酰基供体，赖氨酸残基的e-氨基基团起酰基受体作用。通过酰胺链与赖氨酸和谷氨酰胺残基的侧链实现交联[32]。Nicolas等[33]证明，用转肽酶SortaseA交联得到的水凝胶细胞相容性较好，安全性较高。

4 脱细胞鱼皮基质的优势

4.1 生物相容性好

脱细胞组织的主要成分为胶原蛋白，而胶原蛋白具有免疫原性低[34]、生物降解性好[35]等特点，曾经被认为是一种无抗原性的生物材料[36]。近年来，随着基因工程技术发展，发现胶原蛋白非螺旋末端区的端肽会引起一定免疫原性[37]，而脱细胞过程中加入胰蛋白酶可以有效地去除端肽，降低胶原蛋白本身的免疫原性。经过脱细胞处理的鱼皮不含细胞，一般通过H&E染色和Masson染色[38]判断有无细胞核残留以及胶原纤维和肌原纤维的含量。

4.2 生物降解性强

Baldursson等[4]对比猪小肠黏膜下层脱细胞基质和脱细胞鱼皮基质在全层皮肤损伤治疗时的愈合速率及生物安全性，采用酶联免疫（ELISA）法分析抗核抗体（ANA）、抗盐水可提取性抗原多肽抗体谱（ENA）、抗双链DNA抗体（DSDNA）和抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）等。结果表明：脱细胞鱼皮基质的愈合速度更快，术后28 d伤口完全闭合，生物相容性更好，过程中没有发生免疫排斥反应。脱细胞鱼皮基质的良好抗炎性可能与鱼皮中富含Ω-3等不饱和脂肪酸有关。Ω-3脂肪酸能够刺激巨噬细胞，通过抑制NLRP3炎症小体的活化来预防炎症和代谢紊乱[4]。

4.3 三维结构更利于细胞的迁移与增殖

相比于猪、羊、牛皮，鱼皮的网状层结构有着不同的编织方式，前者的网状层编织是立体三维，方向基本均一，而鱼皮各个网状单元层呈平面二维编织形式，各个网状单元相互叠加，其间主要靠一些纵向细小的胶原纤维束连接[18]。体外试验表明，鱼皮脱细胞基质的三维网状结构比猪或牛皮脱细胞基质更利于细胞的迁移与增殖，可促进血管的再生[39]。

4.4 排除人畜共患病威胁

哺乳动物传染性疾病多发，鱼类特殊的生存环境和鱼皮特有的防护机理，人畜共患病的传播风险远低于哺乳动物。鱼皮中可能存在寄生虫等危险，但脱细胞过程中pH的变化，及脱细胞产品常用的环氧乙烷灭菌处理，能够得到有效去除。

4.5 规避宗教问题

在某些特殊地区，因为宗教信仰等因素，不能使用猪或牛组织提取的胶原蛋白[40]，限制了脱细胞猪皮、牛皮基质在这些地区的临床应用。而脱细胞鱼皮基质则没有这些困扰，这也是近年来提倡使用鱼皮胶原蛋白来替代传统的猪皮或牛皮胶原蛋白的原因。

4.6 水产资源丰富

我国的海岸线总长达3.2万余 km，具有丰富的水产资源。近年来，国家在不断强调对海洋资源的合理开发和利用，提倡中国应该坚持走依海富国、以海强国、人海和谐、合作共赢的发展道路[41]。鱼皮作为水产加工副产物，一直以来利用率较低。若用脱细胞鱼皮基质替代脱细胞猪皮/牛皮基质，应用于组织修复和整容整形行业，将进一步提高水产资源利用率。

5 脱细胞鱼皮基质的临床应用

最早的脱细胞鱼皮产品是美国FDA于2013年批准的KerecisTM，主要用于慢性溃疡创面治疗。该产品在结构上与脱细胞牛皮基质和脱细胞猪皮基质相似，但是，在鱼皮的前处理阶段保留了真皮层中的脂肪，因为鱼皮脂肪中含有丰富的Ω-3等不饱和脂肪酸，有利于降低炎症反应，能够诱导细胞向创伤区域转移[42]。Yang等[42]对KerecisTM的治疗效果进行测试，结果表明在慢性溃疡创面治疗中，KerecisTM表现出优良的修复效果，患者使用KerecisTM5周后，创面面积减少40%，创面深度减少48%。此后，深入研究了脱细胞鱼皮基质。Magnússon等[43]选用大西洋鳕鱼（Gadus morhua）鱼皮制作脱细胞鱼皮基质，用于糖尿病等慢性溃疡的再生修复。Kjartansson等[44]探究KerecisTM对硬脑膜缺损的修复作用。王园园等[18]选用沙鳗鱼皮制作脱细胞基质，用于口腔医学中组织修复。

6 脱细胞鱼皮基质制备中存在的问题

脱细胞鱼皮基质作为一种新型生物支架材料，具有广阔的应用前景。然而，在产品开发和生产中，必须注意几个问题。

6.1 鱼皮种类的选择

不同种类的鱼皮在结构上存在差异，理想的脱细胞鱼皮材料应该具有双层结构，一面光滑、一面疏松多孔，有利于细胞的迁移和黏附。而有些鱼皮材料（如黑鱼Channa argus）呈现出平滑结构，在电镜观察下，两面均无孔隙结构[38]，不利于细胞的迁移和生长。常用的脱细胞鱼皮来源包括鳕鱼（Gadus）、马面鱼（Thamnaconus septentrionalis）和沙鳗鱼。

6.2 季节对于鱼皮性质的影响

Duan等[45]研究发现，捕捞的季节对鲤鱼（Cyprinus carpio）鱼皮明胶的理化性质（氨基酸组成）和流变学特性（黏度特性、凝胶强度和熔点）会产生一定影响，夏季鱼皮明胶的稳定性明显高于冬季。因此，为了保证脱细胞鱼皮基质的性质稳定，选用鱼皮来源及捕捞时间需要合理的规划。

6.3 交联方法和交联剂的选择

鱼皮胶原蛋白的变性温度一般低于37 ℃，在临床应用中容易发生热变性。可以通过交联来提高脱细胞鱼皮基质的机械强度和热稳定性。最常用的化学交联法交联效果较好，但会引入外来有害物质，必须考虑交联剂在人体内的降解速率。

6.4 皮下脂肪的保留

不同于哺乳动物皮肤，鱼皮中含有丰富的不饱和脂肪酸，如Ω-3、二十碳五烯酸、花生四烯酸等，能够一定程度抑制炎症发生，因此在脱细胞前处理中，可以选择性地保留真皮层中的脂肪。

7 结语与展望

近年来，随着生物技术的进步和动物福利的改善，鱼类在生物医学中的应用受到广泛关注，常被用作为陆生哺乳动物的替代模型[46]。除研究鱼皮脱细胞外，国外学者还对鱼体其他部位的生物学功能进行探讨。如Kumar等[47]讨论脱细胞鱼鳔基质在皮肤创面愈合修复中的应用前景。相比于国外相对成熟的脱细胞鱼皮基质制作工艺和评价体系，我国对于脱细胞鱼皮基质的研究才刚刚起步，相关文献也较少。王园园等[18]提出一种利用沙鳗鱼皮制作脱细胞基质的新工艺，作为引导组织修复膜应用于口腔医学中。祖丽皮也·阿不力克木等[38]探究了马面鱼、黑鱼、沙鳗鱼（Astroconger Myriaster）、鲤鱼和鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）鱼皮制成的脱细胞基质的理化特性。结果发现，马面鱼脱细胞鱼皮基质具有多孔孔隙结构，更接近理想的组织工程支架材料，利用鱼皮制备脱细胞基质可行，也完善了脱细胞鱼皮的制备方法。但是，对于脱细胞鱼皮基质的改性及如何保证规模化生产时产品质量的均一性，仍需要进一步研究与探讨。