超分辨荧光共聚焦显微技术进展、自主创新研发和开放共享使用现状

张丽娜，王 晋，李硕果，巫祥云，韩玉刚

(1.中国农业科学院 作物科学研究所，北京 100081；2.国家科技基础条件平台中心，北京 100862；3.中国科学院 生物物理研究所，北京 100101)

1 超分辨荧光共聚焦显微技术进展

细胞内超微结构及其动态变化一直都是生物学研究中的重要内容，自16世纪末期简易显微镜出现，到1665年R·Hooke(罗伯特·虎克)用复合式显微镜观察软木塞的薄切片，发现并命名了cell(细胞)，再到1674年，荷兰显微镜学家Antoni van Leeuwenhoek(安东尼·列文虎克)用自制显微镜首次发现了微生物，随后三个多世纪以来，光学显微成像技术经历了从普通的明场显微镜到荧光显微镜，并进一步发展到激光共聚焦显微镜、双光子显微镜、超分辨率显微镜等不同成像技术，推动生物学研究进入了新时代.

2014年诺贝尔化学奖授予美国科学家Eric Betzig(埃里克·白兹格)和William E.Moerner(威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔)及德国科学家Stefan W.Hell(斯特凡·W·赫尔)，奖励其开创性的贡献使得光学显微成像技术的分辨极限拓展到了纳米尺度.其中，Betzig E等[1]实现了基于光活化(photo-activation)/光转换(photo-convertible)荧光分子的“(荧光)光敏定位成像技术”photo-activated localization microscopy, PALM)，获得了定位精度可达2～25 nm的超分辨率图像.Sahl S J[2]在激光扫描共聚焦光路的基础上，利用荧光分子的受激辐射效应，将一个高强度的耗损光调制成面包圈形状，与激发光束中心准直，之后将两束光一起照射到样品上，通过抑制点扩散函数中心点之外的地方发出荧光的点扫描“受激辐射损耗成像技术”(stimulated emission depletion microscopy，STED)，达到了缩小成像系统实际艾里斑的尺寸的效果，从而实现了提高系统分辨率的目的.随后，他们又进一步发展了“可逆饱和光学荧光转化成像技术”(reversible saturable optical fluorescence transitions，RESOLFT)，以及并行扫描(parallelized scanning, RESOLFT)技术，大幅提升了系统的时间分辨率.

另一种基于傅里叶光学原理发展起来的超分辨成像技术：结构光照明超分辨成像技术，通过不同角度、不同相位的结构光照明，获得了包含不同频率信息的原始数据，通过移频合并获得了远超过系统截止频率范围的更多高频信息的倒空间频谱图，即突破光学系统的衍射极限获得了更高空间频率的样品信息.线性结构光照明超分辨成像技术可以将横向空间分辨率提升至100 nm 左右，纵向分辨率提升到了280 nm[3].而非线性结构光照明(nonlinear SIM，NL SIM)通过控制照明光模式，可以使横向空间分辨率进一步提高到了40 nm[4].随后出现的“贝塞尔光片结构光照明成像技术”(bessel light-sheet SIM)[5]，利用贝塞尔光片照明光路仅对在焦面的荧光分子进行激发成像，有效减少了非焦面荧光分子的发光，大大提升了图像信噪比，也有效降低了三维成像过程中对样品的辐照总剂量.“掠射结构光照明成像”(grazing incidence SIM，GI-SIM)[6]通过掠射(grazing incidence)照明产生一个厚度与物镜景深相匹配的照明光片，实现了快速二维超分辨成像，为多维度生命现象的动态研究提供了强有力的观察手段.

这些新型成像技术“打破”了曾被认为是不可逾越的光学衍射极限，可达到百纳米、甚至十几纳米的光学分辨率，故被称为“超分辨成像技术”(super-resolution microscopy).而自问世以来，超分辨成像技术在观察和发现新的细胞超微结构、功能等方面已经成为不可或缺的利器.

2 市场主流激光共聚焦显微镜技术评价

目前市面上双光子激光共聚焦显微镜主要以徕卡、蔡司和奥林巴斯三家居多.近年来双光子显微镜的技术革新也较快，徕卡SP8 DIVE为2018年最新推出的全光谱式双光子共聚焦.该仪器基于SP8平台，具有更快的扫描速度及灵敏度，双光子外置光谱式扫描检测器，无需更换滤块，可实现双光子发射光全光谱扫描.蔡司的LSM NLO在2014年发布，但技术革新较少，仅检测器部分作了新的改进，整体光路变化不大.从发布至今，围绕着LSM880平台进行的研发升级也较少，只推出了Airyscan，并且蔡司的价格普遍偏高.Olympus的FV MPE，其特点在于系统灵活性高，可以根据客户要求进行改装，且价格低廉，但光学敏感度及重复精度均不理想，软件及硬件的操作较为复杂，应提高人性化设计.

超分辨共聚焦(纳米成像)技术是目前国际上纳米分辨成像领域最先进的成像技术，只有徕卡、通用电气和尼康等几家公司拥有较为成熟的产品.而通用电气的系统为一体化仪器，使用SIM技术，对图像质量进行软件提升，分辨率接近100 nm，缺点是无法对光学功能进行更多的拓展，难以满足厚组织的原位成像分析.尼康公司生产的N-STORM 系列产品，分辨率可以达到20 nm(软件计算)，但是由于需要使用特殊的荧光染料，制样方式复杂难度较大，只能针对薄样品成像，难以适用于活体与组织样本.

徕卡STED的设计以激光扫描系统为构架，可以较为灵活的扩充到纳米成像以及双光子成像等其他方式.但该设备需要的光照度是活细胞可以承受的一百万倍，因此不适于活细胞成像，同时实际分辨率受限于光漂白和光毒性，无法达到用荧光小球测出的理论分辨率[7].例如，徕卡STED承诺可以实现优于50 nm的分辨率，到目前为止仍然无法给出90 nm的Hessian SIM揭示出来的活细胞线粒体内嵴的结构动态[8-9].

3 中国研发高分辨荧光共聚焦显微技术的情况

光学显微已有近400年的历史，在其发展过程中，分辨率的提升是一代又一代学者专家追求的目标.1873年阿贝提出了光学显微镜分辨率受衍射现象的限制，只能达到200 nm左右，无法进一步提升.然而进入本世纪以来，单分子定位显微镜(STORM/PALM)、结构光照明显微镜(SIM)、受激辐射光耗竭显微镜(STED)等显微成像技术掀起了生命科学研究工具的技术革命，把显微镜的分辨率又提升了一个数量级，其中PALM和STED于2014年获得了诺贝尔化学奖.

中国科学院和北京大学为代表的科研团队在超分辨仪器的技术领域取得了重大突破.在结构照明超分辨显微镜领域，北京大学的陈良怡团队[10]和中国科学院生物物理研究所的李栋团队[11]分别发展了海森结构光超高分辨率显微镜和掠入射结构光超分辨成像技术，把分辨率提高到100 nm以内的同时也将时间分辨率提升到数百幅每秒，非常适合细胞器互作等动态过程的研究，并且所需要的光照度小于常用的共聚焦显微镜光照度三个数量级.由于极低的光漂白以及光毒性，实现了高速超高分辨率成像下超长时间的动态观察.在单分子定位显微镜领域，中国科学院生物物理研究所的徐涛和纪伟团队[12]发展了冷冻单分子定位显微镜和一种新型的干涉单分子定位显微镜(repetitive optical selective exposure，ROSE).冷冻单分子定位显微镜在提高分辨率的同时可实现与冷冻电镜融合成像，ROSE显微镜实现了不同干涉条纹下单分子高速成像，避免了闪烁和发光时间短等对定位精度的影响，将单分子定位显微镜的分辨率提升到3 nm以内的分子尺度，定位精度接近1 nm，具有更高的亚细胞结构解析能力.这些技术为生命科学的研究提供了强有力的技术手段，是显微成像领域的重大突破，具有广泛的应用前景.

中国科学院苏州医工所的张运海团队，对入射光进行偏振调制，得到尺寸较小的径向偏振光纵向分量的聚焦光斑，成功提高了现有图像扫描显微成像技术的分辨率，获得了高信噪比且更高分辨率的图像.该技术利用径向偏振光的纵向分量具有紧凑型光斑的特性，获得了较小的照明光斑，并进行图像扫描显微成像，与普通图像扫描成像相比，其分辨率提高了7%[13].

北京大学陈良怡带领的科研团队历时2年研发了智能超高灵敏度活细胞超分辨显微镜(HiS-SIM)[10]，是现有商用超分辨率显微镜中成像灵敏度和分辨率最高的，并配备多种成像模式、操控便捷、高性能图像重建和智能图像处理，产品服务于基础生物学研究、临床医学及病理学研究、精准药物筛选等领域科技人员，重点致力于活细胞超分辨率智能成像解决方案.该设备价格较高，是我国研发的 高端显微镜.另外，中国科学院苏州医工所也开发了商品化的高速双光子显微镜和激光扫描共聚焦显微镜.

4 激光共聚焦显微镜开放共享情况

按照《国务院关于国家重大科研基础设施和大型科研仪器向社会开放的意见》和中央改革办督察组的要求，2019年5月至9月，科技部、财政部会同有关部门，委托国家科技基础条件平台中心，组织开展了2019年中央级高等学校和科研院所等单位科研设施与仪器开放共享评价考核工作[14].

总体看来，与2018年相比，参评单位对开放共享更加重视，科研设备与仪器的利用率进一步提升，支撑科技创新的成效更加显著.参评科研仪器的年平均有效工作机时为1 440 h，平均对外服务机时为240 h.纳入国家网络平台统一管理的仪器入网比例为95%.80%的参评单位建立了在线服务平台，并实现了与国家网络管理平台互联对接，其中中央级高校和科研院所单位的497台激光共聚焦显微镜参加了考核，总运行机时为487 423.34 h，平均运行机时为980.73 h，明显低于参评的科研仪器年平均有效工作机时1 440 h.其中494台激光共聚焦显微镜对外开放共享服务，总服务机时为9 553.90 h，平均对外服务机时为140.80 h，明显低于参评的科研仪器年平均对外服务工作机时240 h.由此可见，激光共聚焦显微镜的整体使用效率需要进一步提升，充分论证新购激光共聚焦显微镜的需求，并在仪器设备查重评议环节严格把关，提高科技资源的高效效率.

总之，超分辨荧光共聚焦显微镜已成为生命科学细胞生物学研究的重要技术手段.2019年我国共购置显微镜316台，国外品牌为主.根据我国评价考核结果分析，高校和科研院所购置的激光共聚焦显微镜使用机时偏低，基本上呈现饱和状态，后续购置应谨慎有序安排.