双阴性T细胞在恶性肿瘤中的治疗机制及其临床应用进展

孙克娜综述，陈英剑审校

1.解放军联勤保障部队第九六〇医院 检验科，山东 济南 250031；2.潍坊医学院 医学检验学院，山东 潍坊 261053

恶性肿瘤是人类死亡的主要原因，人口的快速增长和社会经济的飞速发展使我国的肿瘤发生率处于高水平且不断增长[1-2]。目前大多数恶性肿瘤早期临床症状隐匿，恶性程度高，转移发生早，手术根治率低，预后较差。因此，提高肿瘤患者生存率的关键是早诊断早治疗和探索新的治疗途径。现阶段用于临床诊断的金标准是病理学检查，但因检查费用昂贵，对患者和医师要求高，其辅助手段可能会出现穿孔、出血等不良反应，无法用于大规模初筛[3]。人们在探索治疗新方法的道路上逐渐认识到免疫系统对肿瘤的识别、发生发展和杀伤起重要作用，肿瘤免疫疗法也随之成为研究热点。双阴性T细胞（double negative T cells，DNT）是近年发现的免疫调节性T细胞，属于T淋巴细胞亚群，根据抗原受体组成的不同分为αβT和γδT两群，其表面既不表达CD4也不表达CD8，但可通过免疫抑制调节功能杀伤肿瘤细胞，在机体抗肿瘤中发挥重要作用。我们在此简要概述DNT细胞在肿瘤免疫调控和临床应用领域的研究现状，旨在进一步揭示肿瘤发生、发展和迁移的机制，为临床应用拓宽道路。

1 DNT细胞的来源

T细胞在胸腺发育过程中经历了阳性选择和阴性选择,只有以适当T细胞受体（T cell recep⁃tor，TCR）亲和力发生特异性结合才能分化为CD4+或CD8+T细胞，TCR亲和力过高可能有助于双阳性T细胞（double positive T cells，DPT）逃离阴性选择最终发育为DNT细胞[4]。但有学者认为DNT细胞在特定条件下可以直接来源于CD4+或CD8+T细胞。Zhao等[5]发现T细胞凋亡受损时，增殖的CD4+T细胞在共刺激复合物OX40（CD134）/OX40L的辅助下可直接转化为调节性DNT细胞以维持外周免疫耐受，转化得到的DNT细胞表现出高度抗原特异性，可降低免疫系统介导的组织损伤。孙广永等[6]也发现OX40/OX40L能够抑制DNT细胞凋亡，促进其转化效率，提高其免疫抑制功能。另外，体外活化成熟的鼠CD8+T细胞在高剂量白细胞介素4（IL-4）的刺激下转变为DNT细胞；体内TCR刺激的CD8+T细胞可导致DNT细胞的初始积累[7]。以上结果表明，当体内外免疫条件发生改变时，不同种类的T细胞可直接或间接通过多种途径衍生为DNT细胞。随着对T淋巴细胞亚群研究的不断深入，现已明确调节性T细胞具有多种不同的细胞亚型，但DNT细胞的来源及其内在转化机制尚不完全明晰，主要原因在于不同的DNT细胞可以表达不同的表面标志。

2 DNT细胞在肿瘤治疗中可能存在的调控机制

2.1 DNT细胞通过Fas/FasL途径诱导肿瘤细胞凋亡

表达Fas的靶细胞与FasL结合后，活化并传递凋亡信号，诱导靶细胞进入死亡程序，维持着人体细胞凋亡与增殖的平衡，对机体杀伤肿瘤细胞起到了重要的促进作用[8]。胡丕波等[9]采用ELISA方法在DNT细胞上清液中检测出可溶性FasL（sFasL）高表达。Lu等[10]将DNT细胞与胰腺癌细胞Panc-1共培养后，发现DNT细胞对Panc-1细胞具有杀伤作用且呈剂量依赖型，进一步采用PCR技术发现Panc-1细胞表面Fas表达上调，与Chen等[11]关于DNT细胞可抑制胰腺癌生长的研究结果一致。这些结果充分说明了DNT细胞可通过分泌sFasL与胰腺癌细胞表面的Fas特异性结合介导杀伤胰腺癌细胞。

2.2 DNT细胞通过分泌细胞因子作用于肿瘤细胞

陈炯等[12]发现胰腺癌患者DNT细胞数量与γ干扰素（IFN-γ）含量呈正相关，分泌的IFN-γ随着DNT细胞数量的减少而减少，IFN-γ的降低影响了机体内细胞因子的抗肿瘤作用，这可能与DNT细胞大量分泌IFN-γ有关。同时，DNT细胞的数量与IL-4含量呈负相关，多数研究已经表明DNT细胞不分泌IL-4，这可能与DNT细胞抑制其他免疫细胞使得分泌IL-4含量下降有关。现已明确，IL-2可增强DNT细胞对凋亡的抵抗力及其增殖能力[13]；IFN-γ通过促进DNT细胞表达高水平NKG2D和DNAM-1，增强肿瘤细胞对DNT细胞介导细胞毒性的敏感性[14]。

2.3 DNT细胞通过DNAM-1和NKG2D及其配体途径作用于肿瘤细胞

DNAM-1和NKG2D都是细胞毒性免疫细胞的主要活化受体，在CD8+和CD4+T细胞、NK细胞、DNT细胞上均有表达。Lee等[14]认为IFN-γ可通过诱导NKG2D配体在急性髓细胞白血病（AML）细胞中高表达，使肿瘤细胞对DNT细胞和NK细胞介导的细胞毒性更加敏感，高效发挥DNT细胞的抗肿瘤活性。Lee等[15]在肿瘤免疫治疗中充分证明了通过低剂量硼替佐米来提高NKG2D配体的表达是一种有前途的治疗策略。Kearney等[16]发现，在缺乏DNAM-1配体的情况下，T淋巴细胞亚群对肿瘤的杀伤作用明显减弱，而CD112和CD155的表达是DNAM-1依赖性杀伤AML细胞所必需的。这与Sanchez-Correa等[17]所证明的DNAM-1是与靶细胞中的CD112和CD155相互作用后参与T淋巴细胞亚群杀伤活性共受体的研究结果相一致。由此可见，T淋巴细胞亚群DNAM-1受体表达降低可能是肿瘤逃逸的另一种机制。

2.4 DNT细胞通过TRAIL通路作用于肿瘤细胞

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）通路的抗肿瘤作用受到了国内外学者的重视。赵越[18]等通过检测DNT细胞培养液发现了DNT细胞可分泌可溶性TRAIL（sTRAIL），随后采用免疫组化法观察到TRAIL-R1在胰腺癌癌旁组织中高表达，在胰腺癌组织中的表达相对较少，在高分化胰腺癌组织中的表达高于低分化组织。这说明受体TRAIL-R表达下调后，同TRAIL结合减少，导致肿瘤细胞凋亡减少，从而促进了肿瘤的发生发展。Tawfik等[19]通过胰腺导管腺癌Colo357细胞与γδT细胞共培养发现肿瘤细胞的裂解不受抗TRAIL抗体或TRAIL-R2-Fc融合蛋白的抑制，但TRAIL-R4会使γδT细胞分泌颗粒酶B减少而环加氧酶（COX）2的表达水平升高，增强γδT细胞的抗肿瘤细胞毒性。这说明DNT细胞抗肿瘤通路之间相互调节、相互作用，为调控机制的研究增加了难度。

3 DNT细胞的临床应用

3.1 DNT细胞在肿瘤诊断中的应用

随着对DNT细胞作用机制研究的不断深入，DNT细胞的临床价值越来越受到重视。在老年晚期结直肠癌患者中发现，化疗前患者T淋巴细胞亚群表达明显低于健康组，而化疗后T淋巴细胞亚群表达明显升高[20]。这说明患者治疗前存在明显的免疫抑制状态，治疗前后T淋巴细胞亚群的变化对机体免疫状态的反映具有重要的临床意义和指导作用。B16F10黑色素瘤小鼠体内DNT细胞数量升高且与肿瘤大小呈正相关[21]；肺癌患者和结直肠癌患者外周血中DNT细胞数量均显著增高[22]。胡小倩等[23]在肺肿瘤、乳腺肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤和肠道肿瘤中，也发现恶性肿瘤组外周血CD4+/CD8+比值均明显低于同种良性肿瘤组，DNT细胞比例均明显高于同种良性肿瘤组。我们可以初步认定DNT细胞比例在恶性肿瘤中呈升高趋势，提示其是一种潜在的诊断指标。但DNT细胞的具体作用机制尚不明确，因此，我们无法知悉DNT细胞在恶性肿瘤患者体内是抑制免疫功能、杀伤肿瘤细胞还是保护机体免疫功能。同时，对于恶性肿瘤患者DNT细胞的这种变化是否只是一种代偿机制或其他原因，有待于进一步探讨和证实。

目前多数学者认为，单个肿瘤标志物敏感性和特异性偏低，往往不能满足临床需要。因此，将特异性和相关性较好的几种肿瘤标志物联合起来检测，对提高肿瘤的早期诊断有重要价值。有研究发现[24]，联合检测外周血T淋巴细胞亚群、DNT细胞和血清癌胚抗原（CEA）可将肺癌检出的灵敏度、特异度分别提高至90.8%和98.9%。由此可见，与CEA的联合诊断具有较大的临床应用价值。徐志全等[25]通过回顾性分析92例经根治术治疗的直肠癌患者，发现术前T淋巴细胞亚群与CEA双阳患者的五年生存率最低。通过监测恶性肿瘤患者T淋巴细胞亚群及DNT细胞的表达，将进一步评估患者的抗肿瘤免疫功能，进而为诊断肿瘤、判断患者预后及设计更为切实可行的治疗方案提供理论依据，且方法简便易行，今后有望在基层医院得到深入开展。

3.2 DNT细胞在肿瘤治疗中的应用

几十年来，铂类化疗是治疗晚期肿瘤惟一有效的全身疗法，但化疗患者生存率低，仅8～10个月。利用宿主免疫应答来治疗癌症的免疫疗法成为国内外学者的研究热点，抗PD-1免疫检查点阻断法（ICB）已获准用于临床治疗，但并非对所有肿瘤患者都有效。Fang等[26]发现小鼠体内DNT细胞的过继转移显著抑制晚期肺癌移植瘤的生长，提高了受体小鼠的存活率；在体外离体扩增的DNT细胞对肺癌细胞具有细胞毒性。而在肺组织中DNT细胞可通过分泌高水平IL-10和IFN-γ发挥对正常肺细胞的保护功能[27]。上述结果充分说明DNT细胞的过继性细胞治疗是很有前途的治疗方案。在肿瘤异种移植模型中，抗PD-1可以增加细胞毒性DNT细胞的积累，进一步增强DNT细胞介导的抗肿瘤功能。DNT细胞单独或联合抗PD-1过继细胞治疗肺癌具有重要的临床意义。同时，研究证明DNT细胞的过继性细胞治疗对肝癌患者也具有重要的临床价值[28]。

化疗耐药是临床治疗晚期肿瘤所面临的巨大挑战，目前已发现有多种形式的细胞疗法可用来解决这一难题，但功效低和毒性大阻碍了其在临床中的广泛应用。研究发现，在体外，健康供体来源扩增的DNT细胞可以靶向原代AML细胞，其中包括9例对化疗耐药的患者标本。更重要的是，同种异体DNT细胞不会影响正常造血细胞功能和造血干/祖细胞移植及分化，也不会在受体中引起异种移植物抗宿主病[14,29]。Yao等[30]发现体外扩增的DNT细胞能够有效地靶向大量非小细胞肺癌细胞株，并在体内抑制肺癌的生长，而IL-15的加入可以增强DNT细胞的抗肿瘤作用，这是因为IL-15可以上调DNT细胞识别肿瘤的先天性受体，DNT细胞与IL-15联用可进一步缓解机体化疗耐药。上述研究说明DNT细胞免疫疗法对治疗靶向化疗耐药和预防肿瘤复发具有充分的可行性，但DNT细胞在肿瘤中的作用机制尚不完全明确，这也为推动临床广泛应用增加了难度。

4 结语

当机体发生癌变时，免疫系统会及时做出反应。虽然，有研究报道DNT细胞在肿瘤诊断和过继免疫治疗中具有可行性，但下一步需要扩大样本量，对DNT细胞的临床价值进行充分验证。另外，目前的研究大多源于动物模型，相对于复杂的人体系统来说，将DNT细胞的理论研究应用于临床仍有许多问题亟待解决。DNT细胞免疫调控途径之间存在相互调节、相互制约，这为研究免疫治疗调控机制带来挑战。深入探讨DNT细胞与肿瘤免疫之间的关系，有助于进一步揭示肿瘤发生发展及迁移机制，从而有利于提高DNT细胞杀伤肿瘤细胞的能力，增强机体的反应性，为DNT细胞临床免疫治疗及预后评估提供新方案。