反向遗传学技术在流感病毒减毒活疫苗研究中的应用进展

孙瑾 ，石岩刚 ，董铭心 ，王斌

1.青岛大学 基础医学院，山东 青岛 266071；2.航天科工集团七三一医院 神经内科，北京100074

流感病毒是一种包膜病毒，属于正黏病毒科，其基因组包含8个片段，包括表面抗原神经氨酸酶（neuraminidase，NA）和血凝素（hemagglutinin，HA）、3种聚合酶（polymerase B1，PB1；polymerase B2，PB2；polymerase A，PA）、核蛋白（nucleopro⁃tein，NP）、基质蛋白（matrix protein）及非结构蛋白（non-structure protein），是分节段的单负链RNA病毒。流感病毒的每个片段编码1～2个结构蛋白，每个片段的3'和5'端是病毒的包装信号[1]，包括开放读框（open reading frame，ORF）的最两端及 3'、5'端的非编码区（noncoding region，NCR）。根据内部抗原核蛋白的不同，流感病毒可分为甲、乙、丙共3型，其中表面抗原HA有18个亚型，NA有11个亚型[2]，又将甲型流感病毒分为若干亚型。研究表明，流感病毒的RNA聚合酶不具有校正作用[3]，因此RNA复制过程中易发生点突变而导致抗原漂移，使得疫苗对其失效，最终引发小范围的流感流行。而当2种或2种以上的甲型流感病毒感染同一宿主时，容易发生2种病毒的基因组重配，形成一种与之前流行株结构不同的新亚型，人群中缺乏对该病毒的免疫力，由此而发生流感大暴发[4]。

接种疫苗是预防流感的最经济有效的医学措施[5]，而研制安全性好、能够保留病毒所有抗原以激发机体全面有效的免疫反应的活病毒疫苗是科研人员的研究目标。随着反向遗传学技术的逐渐成熟，其在病毒活疫苗的研发过程中也发挥着越来越大的作用，使病毒包装更加简便，减毒方法更加新颖多元。在此，我们简要介绍反向遗传学及技术，并对其在流感病毒活疫苗研究中的应用进展进行综述。

1 反向遗传学在病毒研究中的应用

经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发展规律，而反向遗传学则是从生物的遗传物质入手，在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰（如突变、插入或缺失等），再组成含有生物体所必需元件的基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状的影响等方面的内容，与之相关的一系列技术称为反向遗传学技术。反向遗传学技术通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）获得RNA病毒的全部cDNA序列，克隆于合适的载体上，构建出含有病毒全长cDNA序列的质粒以转染细胞，包装出具有活性的病毒颗粒。此技术实现了病毒的包装以及在体外对病毒遗传物质的修饰，推进了病毒结构蛋白功能、致病机制的研究及获取重组病毒疫苗。

由于正链RNA病毒基因组也可作为mRNA，因此其具有感染性，直接转染病毒cDNA即可获得完整的具有感染性的病毒颗粒，因此反向遗传学技术最初成功用于正链RNA病毒，如Qβ噬菌体[6]、脊髓灰质炎病毒[7]。而负链RNA病毒由于单独基因组不具有感染性，其最小感染单位是基因组与核蛋白及RNA聚合酶所组成的核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），且基因组与 mRNA 互补，易发生杂交而干扰基因组RNA与RNP的装配，从而导致操作更加复杂。1994年Schnell等使细胞预先表达狂犬病毒核蛋白与聚合酶蛋白后，将含有病毒全长反义基因组（正链RNA）的质粒转入细胞，获得了感染性病毒颗粒，最先利用反向遗传学技术在不分节段的负链RNA病毒狂犬病毒中实现了病毒的成功拯救[8]。受此思路启发，随后连续成功拯救麻疹病毒[9]、仙台病毒[10]、水泡口炎病毒[11]。1996年第一个分节段负链RNA病毒布尼亚病毒拯救成功[12]，为流感病毒的拯救提供了可能性。

2 流感病毒反向遗传学技术的发展

Luytjes等[13]于1989年首次借助辅助病毒拯救出了流感病毒。他们将构建的含有氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）的质粒以体外转录的方式获得RNA，并将其与纯化的流感病毒核蛋白与聚合酶于体外孵育成RNP样粒子后转染MDCK细胞，在辅助病毒感染的作用下，成功拯救出含有外源基因CAT的流感病毒，且能顺利传代。

Neumann等[14]在1999年用12/17质粒系统以全部克隆的cDNA获得了流感病毒，这种方法所得病毒滴度高，使得引入任意定向突变成为可能，且不依赖于辅助病毒，但需要一套专门表达病毒核蛋白与聚合酶的质粒系统，所需质粒较多。2000年，Hoffmann等[15]建立了一套八质粒系统以获得流感病毒，该系统运用了双向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ元件，能够从cDNA中表达结构蛋白且获得病毒RNA（vRNA），大大减少了质粒数量，更加方便快捷，且该技术目前运用最为广泛成熟。此后，Neumann等[16]在2005年对八质粒系统进行了改进，构建了可以合成流感病毒8个节段vRNA的单质粒，该质粒合并表达病毒核蛋白及聚合酶的质粒亦可成功拯救病毒，这个系统只需3个质粒，但质粒构建难度较大，目前应用并不太广泛，同时该系统研究中出现一种特殊情况，该质粒单独转染293T细胞，在没有聚合酶及核蛋白表达质粒的情况下，仅有vRNA也包装出了流感病毒，其机制尚不清楚，有待研究。

2018年周珊珊等[17]在流感病毒八质粒系统的基础上改进得到两质粒系统，成功装配流感病毒H1N1。他们将流感病毒的PB1、PB2、PA、NP、M、NS等6个内部基因的双向转录表达元件克隆进同一载体，获得pfastbacΔplhHTBP6质粒，将表面基因HA、NA双向转录表达元件克隆进同一载体获得pENTR-1AP2质粒，2质粒共转染COS-1和MDCK共培养细胞层包装出流感病毒。该系统病毒包装效率较八质粒系统更高且更加简便快捷，为流感疫苗的研发提供了新思路。

3 反向遗传学技术在流感病毒活疫苗研究中的应用

3.1 利用基因重组方法获得减毒活疫苗

基于流感病毒八质粒系统的成熟应用及其基因组分节段的特点，研究人员常选择对同亚型或不同亚型病毒株的基因片段进行重组或重排，以获得毒力减弱且多价的减毒疫苗株。Gao等[18]在2009年利用反向遗传学技术互换了H1N1（PR8毒株）的HA与NS片段的包装序列，即将HA与NS基因3'与5'端的包装序列分别放置在NS与HA开放读框两侧，成功拯救了带有嵌合片段的重组病毒。该病毒生长良好，且与野生型病毒感染同一宿主时仍具有重配能力。为解决多病毒基因重配问题，他们借鉴前人研究在包装序列中引入沉默突变消除了原始包装序列，使2个嵌合片段携带特异性包装序列，由此重组病毒丧失了基因重配能力，增加了该疫苗株的安全性。对不同亚型之间的基因重组也在不断探索中，2013年Lindomar等[19]构建了一种可针对H5N1和H9N2的重组流感病毒疫苗株。他们将NEP结构域从H9N2病毒的NS片段中去除，并用H5N1病毒的HA片段取代，H9N2的NS1和H5N1的HA被口蹄疫病毒（FMDV）的2A自切割位点分隔，以允许2种蛋白共线性表达。然后将NEP克隆到H9N2 PB1片段下游，两者之间仍由FMDV 2A自切割位点分隔。表达H5N1 HA的重组H9N2病毒可为小鼠和雪貂提供针对H5N1和H9N2的完全保护，同样可以抵抗潜在流行的H9病毒。

2016年Nogales等基于重组PR8的M、NS片段建立了更加安全而有效的流感减毒活疫苗[20]。流感病毒第7、8节段的M、NS基因分别编码2种多肽M1、M2及NS1、NEP，且M1、M2共用N端前9个氨基酸，NS、NEP共用N端前10个氨基酸[21]。他们利用这一特点，在M、NS片段中分别加入1型猪肠病毒（PTV-1）的2A自切割多肽位点，将M1/M2、NS/NEP的OFR分开。根据2A多肽所插入的片段，将3株不同的重组病毒分别命名为Ms、NSs、Ms/NSs，且3株病毒均被成功拯救。经过一系列细胞与动物实验证明3株重组病毒的毒力均低于野生型PR8病毒，且Ms、Ms/NSs这2株含有M分离片段的毒株的免疫性与保护性均优于先前所构建的PR8温度敏感型活疫苗[22]。

3.2 通过改造NS基因获得减毒活疫苗

NS蛋白由NS1与NEP蛋白构成，其中NS1是流感病毒拮抗宿主先天性免疫Ⅰ型干扰素应答的功能性蛋白[23-24]，NEP是病毒复制所必需的蛋白[25]，因此NS蛋白成为减毒活疫苗研究中的理想靶点。2007年Baskin等[26]通过反向遗传学对NS蛋白进行截短，只保留了其1～126位氨基酸残基，构建了一株重组H1N1减毒活疫苗。这株疫苗能够引起有效的体液免疫与细胞免疫，使宿主动物对野生型H1N1获得有效的免疫力。2014年No⁃gale等[27]通过全基因合成对H1N1（PR8毒株）的NS片段进行多位点同义突变，实现了NS蛋白的密码子去优化，产生了一株重组H1N1（PR8毒株）。研究结果表明，对NS蛋白进行密码子去优化后，病毒毒力有效减弱，且能够使宿主获得对同源及异源流感病毒的保护性免疫。

3.3 利用遗传密码扩充获得减毒活疫苗

研究表明，终止密码子UGA和UAG在生命进化过程中发生了变义。1986年Chambers等[28]发现终止密码子UGA编码第21种天然氨基酸硒半胱氨酸，这种氨基酸能在古细菌、哺乳动物如小鼠体内发现[29-30]；2002年发现终止密码子UGA编码第22种天然氨基酸吡咯赖氨酸，这种氨基酸是在甲烷八叠球菌属巴氏细菌的特殊环境中编码出来的[31]。在RNA翻译成蛋白质过程中，氨酰tRNA合成酶使对应的tRNA氨酰化，携带上其对应的氨基酸。随后氨酰化的tRNA对应mRNA上特定密码子，把氨基酸送入核糖体内以添加到正在增长的肽链中。遗传密码扩充技术就是通过在生命体内引入与非天然氨基酸对应的tRNA及tRNA合成酶，并使它们与特殊的密码子对应，从而将非天然氨基酸通过基因表达结合到蛋白质中[32]。

Si等[33]通过稳定表达吡咯赖氨酸正交翻译系统的转基因细胞系，获得了含有终止密码子UAG的复制缺陷型流感病毒，该病毒株可在转基因细胞系中稳定复制，但在普通细胞中无法复制，使得作为活疫苗的安全性大大提高。结果表明，遗传密码扩充技术可用于流感减毒活疫苗的研发，该病毒疫苗免疫动物可对不同流感病毒产生有效的体液、黏膜和细胞免疫应答；另外该疫苗还具有治疗作用，可与感染的野生毒株重组后导致野生毒株的复制能力消失。该方法为疫苗研发提供了新思路，是疫苗研究中的一大突破。

4 结语

减毒活疫苗具有高度的免疫原性，可诱导安全有效的体液、黏膜和细胞免疫，具有良好的保护作用[34]。反向遗传学技术加速了活病毒疫苗的研发进程，它能够明确靶向改造病毒的某个蛋白，截短或突变能够拮抗先天性免疫的NS[27,35]，突变M蛋白以及利用遗传密码扩充对病毒的复制能力进行限制[33,36]，以降低病毒的毒力，也能够通过基因重组构建多价疫苗并解决容易发生基因重配的问题[18-19]，从而达到更加安全、有效的目的。此外，反向遗产学技术能够在病毒的入侵、复制、致病力、调控机制等各方面研究中发挥重大作用，从而帮助紧急应对新型变异病毒的出现，进而促进疫苗的研发。

综上，我们讨论了反向遗传学技术在流感减毒活疫苗研究中的应用。无论是基因重组还是遗传密码扩充，人们都是借助这项技术有目的地对流感病毒基因组进行改造，以获得有效的减毒活疫苗。反向遗传学技术已经越来越成熟，在生命科学研究中的应用也越来越广泛，尤其在RNA病毒的研究及疫苗研发中做出了巨大贡献。我们有理由相信，这项技术能够帮助减毒活疫苗研发取得更大的突破。