基于化学蛋白质组学的药物靶标鉴定

宫 莉, 康经武*

(1. 生命有机化学国家重点实验室, 中国科学院上海有机化学研究所分子合成科学卓越创新中心, 上海 200032; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

现代药物的发现是基于细胞表型筛选或者是针对特定疾病的药物靶标的筛选[1]。在过去的30多年中,得益于分子生物学和基因组学的进步,基于靶标筛选的药物发现策略一直占主导地位。但是近年来的研究表明,通过细胞表型筛选发现新药的成功率高于靶标筛选[2]。这是因为表型筛选获得的生物活性化合物建立在病理相关的细胞模型之上,而不限于单一的基因或蛋白质。因此表型筛选又重新受到制药界的重视[3,4]。但是,基于表型的筛选无法提供活性化合物作用机理的信息,因此需要回溯鉴定那些因与小分子药物直接发生作用而引起功能改变的蛋白质。这一过程被称为药物靶标去卷积(drug target deconvolution)。药物靶标的鉴定不仅可以建立药物活性与细胞表型之间的联系,阐明药物的作用机理;还可以发现药物的脱靶效应和耐药性机制,发现治疗药物的新靶点;并在药物发现的早期阶段预测潜在的副作用和毒性,从而降低研发失败的风险。靶标鉴定不仅是现代药物发现的工作重点,也是化学生物学研究中的关键环节。虽然目前在科学发现和技术进步上取得了飞速发展,但是鉴定药物靶标却依然是一件令人生畏的工作[5]。

亲和色谱纯化结合HPLC-MS/MS分析的蛋白质组学已经成为标准的靶标鉴定策略[6]。经过化学修饰的药物分子生物素化,与细胞裂解液孵育后用链霉亲和素磁珠富集特异性结合的蛋白质,或者先固定在亲和基质(琼脂糖、葡聚糖凝胶或者磁性颗粒)表面[7,8],再从细胞裂解液(或组织匀浆)中富集纯化药物靶标,然后用定量蛋白质技术鉴定蛋白质组[9,10]。细胞中大约有2万种蛋白质,通过亲和纯化能够极大地简化质谱数据的复杂程度[9-12]。但是这一策略的缺点也很明显:需要对小分子药物进行化学修饰以便引入官能团(连接臂),而化学修饰过程不仅耗时费力,还可能会影响小分子药物与蛋白质的结合,而且有些小分子药物无法进行化学修饰。为此,Bantscheff等[13]发展了kinobeads技术,很好地解决了这一问题。kinobeads技术是将一组容易修饰的非特异性激酶抑制剂共价键合在葡聚糖树脂颗粒上,用于无差异化地(理论上)富集细胞裂解液中的激酶组(kinomes)。将需要鉴定靶标的激酶抑制剂与kinobeads一同在细胞裂解液中孵育。如果通过亲和竞争使kinobeads富集到的蛋白激酶组中丢失那些与待测化合物结合的蛋白激酶,通过定量蛋白质组学同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)分析就可以检测到缺失的蛋白激酶,这样就可以从上百个内源性蛋白激酶中鉴定到蛋白激酶抑制剂药物的靶标[14]。最近,Klaeger等[15]用这一方法全面研究了243个激酶抑制剂药物的靶标谱、脱靶效应、选择性以及剂量响应特征。同样的原理也被用来在蛋白质组层面评价组蛋白去乙酰化酶抑制剂的选择性[16]。此外,基于活性的探测分析(activity based probe profiling, ABPP)在靶标鉴定方面也显示了强大的能力。最近,Wang等[17]采用ABPP技术揭示了衣康酸酯调节细胞糖酵解的作用靶标。由于篇幅所限,本文不对ABPP技术做更多的讨论。

近年来,无化学修饰的药物靶标鉴定技术得到了快速发展[18,19]。这些技术都是基于药物分子与靶标蛋白结合后会增强蛋白质结构稳定性,从而提高对蛋白酶水解、化学变性和热变性的耐受程度。药物亲和响应的靶标稳定性技术(drug affinity-responsive target stability, DARTS)利用了结合药物小分子的靶标蛋白具有增强抗蛋白质水解能力的原理进行药物靶标的鉴定[20]。在此基础上发展的限制性酶解-质谱分析技术(limited proteolysis mass spectrometry, LiP-MS)可以在复杂的细胞环境中鉴定药物的靶标[21]。相比选择性切割赖氨酸和精氨酸位点的胰蛋白酶,蛋白酶K切割的位点更宽,脂肪族和芳香组氨基酸的位点都可以被切断,因此属于非选择性的蛋白酶。用低浓度的非选择性蛋白酶K对细胞裂解液进行有限的蛋白水解时将优先切割蛋白质暴露在外的柔性部分(环或者未折叠部分)。药物靶标蛋白由于结合了药物分子,结构变得更紧密和稳定,因而不容易被蛋白酶K水解。经过变性和胰蛋白酶消化后,用LC-MS分析肽段混合物。这样,对比用药物处理和未被药物处理的细胞裂解液的蛋白酶K水解和随后的胰蛋白酶水解肽段的水解程度,就可以靶标蛋白。LiP-MS技术可以平行测试多组样品,样品制备大约需要两天,然后需要一到几天的质谱和数据分析时间[22];最近这一技术被用于研究精氨酸对免疫细胞的调控作用[23]。LiP-MS对低丰度蛋白质的检测具有挑战性,且不太适用于膜蛋白的研究。

蛋白质受热后会发生变性,不可逆地打开折叠结构,露出疏水核心并产生沉淀[24]。蛋白质热稳定性的变化经常被用来研究蛋白质与配体的结合[25]。结合了药物分子的蛋白质具有更稳定的结构,具有更高的变性温度点从而使蛋白质的溶解曲线发生位移。用溶解蛋白质的量作温度的函数可以得到蛋白质的变性曲线(protein melt curves),由此可以确定蛋白质的变性温度点或蛋白质的熔点(melting point)。细胞热位移检测(cellular thermal shift assay, CETSA)可以在活细胞水平检测药物分子与靶标蛋白的结合[26,27]。最初的CETSA实验采用免疫印迹结合微孔板读数的方式进行检测,在同一时间只能研究少量的靶标蛋白。将CETSA技术与基于质谱的蛋白质组学技术结合,可实现在蛋白组层面上高通量研究药物与蛋白质的相互作用[28]。在CETSA-MS技术中,活细胞或细胞裂解液与待测化合物或空白孵育,分别用不同的温度加热,离心除去热变性的蛋白质后,溶解的蛋白质用基于质谱的定量蛋白质组学技术测定就可以鉴定到那些因药物处理而使热稳定性发生改变的蛋白质。CETSA-MS也被称为热蛋白组分析(thermal proteome profiling, TPP)[28]。这一方法能够无差异化地鉴定到药物直接作用的靶标蛋白和脱靶蛋白,以及它们作用于生化通路上的间接下游影响。Becher等[29]采用TPP结合亲和纯化和化学蛋白质组学,发现苯丙氨酸氧化酶是治疗多发性骨髓瘤药物panobinostat的新靶标。他们发展的二维TPP技术(2D-TPP)甚至可以鉴定引起微小热稳定位移的药物靶标。在2D-TPP方法中,蛋白质以剂量依赖性的方式稳定下来,这增加了额外的数据质量,可有效减少假阳性结果。然而此类方法不适用于在溶解温度附近没有显著温度变化的靶标蛋白。

基于氧化速率的蛋白质稳定性测定方法也被用于药物的靶标鉴定(stability of proteins from rates of oxidation, SPROX)[30]。SPROX具有与热稳定性技术相同的原理,结合药物后的蛋白质不容易被化学变性剂诱导发生变性(去折叠),蛋白质上的甲硫氨酸残基也不容易被氧化。用过氧化氢介导的甲硫氨酸残基氧化速率作化学变性剂(例如盐酸胍或尿素)浓度的函数,就可以测定蛋白质和蛋白质-药物复合物的热力学稳定性,从而确定靶标蛋白。通过iTRAQ标记的定量蛋白质组学,SPROX实验可以同时测定复杂的生物样品中与药物分子结合的数百种蛋白质,也可以测定小分子药物的靶标蛋白和脱靶蛋白[30]。SPROX技术的局限性在于需通过含有甲硫氨酸的多肽进行定量,且标准曲线的绘制也需大量的样品,这也限制了此技术的进一步应用。最近,叶明亮课题组[31]发展了有机溶剂诱导的蛋白质沉淀方法(solvent-induced protein precipitation, SIP),在蛋白质组层面鉴定药物的靶标和脱靶效应。作者发现结合了药物的靶标蛋白更不容易被有机溶剂变性沉淀。利用这一方法,作者发现NDUFV1是热休克蛋白Hsp90的特异性抑制剂geldanamycin的新靶标。

药物靶标的鉴定是一直困扰着药物发现和化学生物学研究的一个技术瓶颈。发展准确和高通量的靶标鉴定方法不仅有助于加速药物研发的进程,降低研发消耗,也为发现新的治疗药物提供巨大的机会。亲和色谱结合质谱分析已经成为鉴定药物靶标不可或缺的技术。近年来,基于质谱的定量蛋白质组学技术的兴起改变了生命科学研究的方式,极大地推动了生命科学研究的进程[32];也为药物靶标的鉴定方式带来了革命性的变革。如何实现从上万种蛋白质中快速找到真正的药物靶标,依然需要发展更好的分析技术。