丁酸调控幼龄反刍动物瘤胃上皮发育研究进展

王璐 刘理想 孙大明 刘军花

（1. 国家动物消化道营养国际联合研究中心 江苏省消化道营养与动物健康重点实验室 南京农业大学消化道微生物研究室，南京 210095；2. 动物科学类国家级实验教学示范中心 南京农业大学，南京 210095）

1 幼龄反刍动物瘤胃上皮的生长发育

反刍动物的胃分为4部分，分别为瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。瘤胃是反刍动物主要消化吸收代谢的场所。瘤胃微生物发酵产生的挥发性脂肪酸（VFA）被瘤胃上皮吸收代谢，可为机体提供70%以上的能量需要。同时，瘤胃上皮还起着重要的免疫和屏障作用，其形态及功能的完善对保证反刍动物健康具有重要意义。因此，利用营养调控手段促进幼龄反刍动物瘤胃上皮发育完善是保证动物健康及提高生产效率的关键［1］。

1.1 瘤胃上皮的形态结构及功能

瘤胃壁由内到外由黏膜层（瘤胃上皮）、肌层和浆膜层3层组成。黏膜层呈棕黄色或棕黑色，表面分布着大量向瘤胃腔内突出的上皮乳头。瘤胃乳头的生长增加了瘤胃上皮的吸收表面积。因此，了解瘤胃乳头生长的机理，对于制定提高反刍动物生产性能的策略具有重要意义［2］。众所周知，当饲料来源由母乳过渡为粗饲料或精料开食料时，瘤胃乳头快速发育［3］。瘤胃微生物发酵碳水化合物的产物VFA可诱导瘤胃乳头生长，丁酸是瘤胃乳头生长最有效的激活剂［4］。不同成年反刍动物的瘤胃乳头长度存在较大差异，牛约1 cm，羊约0.5 cm［2］。瘤胃乳头可增加瘤胃上皮与底物的接触面积，促进机体对营养物质的吸收和转运。

瘤胃上皮由角质层、颗粒层、棘突层和基底层4层组成［5］，每一层都有其独特的结构和生物学功能。角质层细胞内含有大量的角蛋白，是瘤胃内环境与外环境的重要物理性屏障［6］。颗粒层细胞呈扁平状，细胞间由桥粒连接，是上皮的主要渗透屏障，可有效阻止外来物质扩散进入上皮底层。棘突层细胞呈椭圆形，有锯齿状边缘。基底层细胞是柱状细胞牢固地附着在基底膜上。棘突层细胞和基底层细胞含有功能完善的线粒体等其他细胞器，这些细胞成分有助于瘤胃上皮代谢，主要是把部分VFA转化成酮体［7］。同时，基底层细胞还参与瘤胃上皮细胞的更新与修补。

1.2 瘤胃上皮的组织形态发育

与成年反刍动物其他功能器官占空腹体重的百分比下降相反，在断奶过程中，瘤胃占胃肠道总容积从30%上升到70%［8］。由于未断奶反刍动物需要消化和吸收母乳中的营养物质，因此小肠在此过程中起主要作用［9］。幼龄反刍动物的瘤胃上皮生理和代谢发育都不完全，瘤胃上皮未表现出高度角质化特征［10］。幼龄反刍动物摄入固体饲料后，瘤胃经过物理和化学的作用逐渐发育成熟。早期的研究表明，瘤胃中饲料的物理刺激可以显著增加瘤胃的重量和肌肉组织发育［11］。因此，为了促进瘤胃上皮的正常发育，必须建立一个可行的瘤胃发酵过程，这表明在瘤胃腔内存在VFA以促进正常乳头的发育［11］。幼龄反刍动物在生命的最初几个月如仅靠母乳饲喂，则使瘤胃重量、瘤胃容量、乳头生长、角质化程度、色素沉积和肌肉组织不能很好发育［8，10，12］，这是由于通过食管沟的反射性闭合将母乳直接分流至皱胃［13］，从而阻止了用于瘤胃发酵的底物进入瘤胃。有研究表明，当液态奶直接灌入瘤胃时可产生VFA并刺激瘤胃乳头生长［12］。同时，相关研究也表明，口腔灌注一定浓度的VFA可导致羔羊瘤胃乳头长度增加［14］。研究表明开食料中增加精料的量并没有导致瘤胃肌层的改变，但确实增加了新生犊牛和羔羊的乳头密度和乳头长度［3］。丁酸和丙酸代谢可能引起瘤胃上皮细胞血流量的增加，也可直接影响瘤胃上皮生长发育相关基因表达［15］。

1.3 瘤胃上皮功能的发育

饲料中的碳水化合物经过前段消化道发酵产生的VFA可为反刍动物提供70%以上的能量需要。大部分VFA直接从瘤网胃吸收进入血液，约20%进入瓣胃和真胃吸收，只有少部分随食糜进入小肠。丁酸在瘤胃上皮中主要参与线粒体内的生酮作用，约80%的丁酸转化为酮体（乙酰乙酸和β-羟基丁酸），该过程产生的ATP将为瘤胃上皮细胞提供80%以上的能量来源［16-17］。酮体主要来自瘤胃中产生的丁酸，但在哺乳初期，它们也来自脂肪组织的代谢。VFA代谢产生的酮体、乳酸及丙氨酸等进入血液后也是合成动物性产品（羊肉或牛奶）的重要前体物质，与动物生产性能的发挥息息相关。

瘤胃上皮细胞吸收的VFA，在瘤胃内腔以解离状态和未解离状态两种形式存在［18］，通过氧化代谢通路氧化产生CO2，之后经过碳酸酐酶的催化作用产生碳酸，碳酸又水解成氢离子和碳酸氢根离子。由于Na+吸收与H+分泌到腔内的含量增加相关，因此Na+/H+交换剂是影响细胞内VFA解离产生H+的主要原因［19］。腔内H+的增加会促进腔内微环境中VFA的质子化，从而促进HSCFA的被动扩散［19］。瘤胃上皮的SCFA-/HCO3-转运蛋白可以将SCFA-转运到瘤胃上皮细胞质基质内［20-21］。研究表明，由上皮碳酸酐酶合成或基底外侧吸收而分泌的碳酸氢盐可稳定瘤胃pH值［22］。在瘤胃上皮发现的阴离子交换剂也有助于碳酸氢盐和SCFA-的交换，这进一步有助于提高瘤胃pH值［23］。

反刍动物瘤胃上皮具有独特的代谢机制，可防止外周血中丁酸的出现，即瘤胃上皮中的高丁酰辅酶合成酶活性可确保丁酸的快速活化，由上皮细胞氧化成β-羟基丁酸。丁酸通过瘤胃上皮代谢，很容易从肝脏门脉血液中移除高位丁酰辅酶A合成酶活性，可确保快速活化和随后对酮体的代谢。来自绵羊肝脏的酰基辅酶A合成酶特异性地作用于C3至C7直链脂肪酸。酰基辅酶A来自绵羊肾的合成酶对C3至C7直链脂肪酸具有特异性［24］。这些VFA是通过碳水化合物在瘤胃中发酵产生的，并且在反刍动物中主要用作变性基质。反刍动物优先利用VFA可能与脂肪酸活化酶的水平有关。而且，酰基辅酶A合成酶通常是非平衡酶，可以在控制整个细胞过程中发挥作用。因此，乙酸、丙酸和丁酸活化反应可以作为VFA代谢中的重要调节步骤［24］。

幼龄反刍动物的瘤胃很小且功能尚未发育完全，占总胃肠道容积的30%，只表现乳头发育的原始状态，但成年绵羊的瘤胃占胃肠道容积的80%，且瘤胃乳头发育基本完全，瘤胃上皮细胞发生角质化［25］。瘤胃上皮代谢变化与形态发育相协调，包括葡萄糖氧化减少，VFA氧化及酮体量增加［26］。犊牛单独饲喂母乳时瘤胃几乎没有发育，但是向幼龄反刍动物饲喂固体饲料后，瘤胃体积和重量以及乳头长度和密度都明显增加［27］。由此说明，瘤胃的生长和肌肉的发育前提是存在固体饲料，而瘤胃微生物发酵产生的VFA也是瘤胃上皮形态及功能发育所必需的。

有研究表明，丁酸对瘤胃上皮发育的刺激作用最大，丙酸对瘤胃上皮的刺激作用略小于丁酸，但远大于乙酸所产生的刺激作用。因此，可以合理地预测，瘤胃上皮的发育程度与化合物的生理或生化活性有关。据报道称，瘤胃中脂肪酸增加会导致瘤胃血流量增加，且相对增加速率为丁酸＞丙酸＞乙酸［28］。有研究发现，瘤胃乳头的生长很可能是瘤胃壁代谢某些化合物或脂肪酸对血流量影响的结果［28］。在体外试验培养基中添加丁酸可抑制瘤胃上皮细胞对葡萄糖的利用，同样，添加葡萄糖也抑制对丁酸的利用［29］。也有研究表明，在羔羊84日龄前，葡萄糖和丁酸被瘤胃上皮细胞利用的效率随日龄增长变化不明显，一直到42日龄后才在培养基中检测到β-羟丁酸，但到84日龄时，β-羟丁酸的浓度已经接近成年水平［30］。研究发现，随着羔羊日龄的增加（0-84日龄），瘤胃上皮细胞3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶和乙酰乙酸辅酶A硫解酶的mRNA表达量也在上升，到84日龄时即达到成年水平，且不受日粮和瘤胃内VFA的影响［14］，表明瘤胃上皮的代谢功能随日龄的增长而逐渐增强。

2 丁酸与幼龄反刍动物瘤胃上皮发育

2.1 瘤胃内丁酸的主要来源

幼龄反刍动物的瘤胃尚未发育完全，因此瘤胃中丁酸的主要来源是饲喂乳中存在的丁酸。尽管母乳中的游离丁酸浓度相对较低（0.16 g/L），但它可能足以影响瘤胃的发育和功能［31］。随着反刍动物日龄的不断增加，瘤胃中的丁酸主要是由瘤胃微生物发酵碳水化合物而产生。在瘤胃中产生的3种主要VFA（乙酸，丙酸和丁酸）中，丁酸含量最少，根据日粮组成，其在总发酵酸中的摩尔比例可在5%-20% 之间［32］。

2.2 日粮丁酸补饲

幼龄反刍动物刚出生时主要饲料来源是液态奶，摄入的固体饲料含量较少，此时瘤胃微生物菌群体系尚未健全。这导致瘤胃中可利用的丁酸非常低，直至反刍动物大量摄入固体饲料并建立瘤胃微生物区系和瘤胃发酵模式后，瘤胃中丁酸水平才显著增加［33-34］。此外，由于考虑到经济效应，代乳料通常代替全脂乳被用作幼龄反刍动物的日粮。但有研究表明，代乳料会使瘤胃发育迟缓，主要是由于其缺乏乳脂以及植物来源的抗营养因子［35］。并且植物（棕榈油，椰子油）或动物（猪油，牛脂）替代品基本不能满足幼龄反刍动物所需的丁酸含量。因此，日粮丁酸补饲可以作为一种促进幼龄反刍动物瘤胃发育的手段。

2.2.1 丁酸的性质和功能 丁酸又称酪酸，为无色至浅黄色透明油状液体，有腐臭的酸味。与水混溶，易溶于有机溶剂。丁酸可以从哺乳动物肠道中膳食纤维的细菌以及汗液甚至粪便中提取，也是牛乳的成分之一［36］。丁酸有抑制肿瘤细胞增殖分化，诱导癌细胞凋亡，增强机体免疫和抗病能力，维护肠道的正常机能的作用［37-38］。

2.2.2 日粮丁酸的来源和形式 丁酸主要以丁酸盐或丁酸酯的形式作用［39］，相对于游离丁酸，使用丁酸盐或丁酸酯的主要优点是它们在饲料生产过程中更稳定，缓解丁酸的腐臭味，不易快速挥发且更易于处理［31］。然而，不同来源的丁酸添加剂具有不同的性质和作用。丁酸钠是丁酸最常用的添加形式，性价比较高，且易溶于水并迅速在水溶液中解离［40］。日粮中添加的丁酸钠在瘤胃中迅速解离并且大部分被胃肠道吸收。与丁酸钠相比，丁酸钙在水溶液中较难溶解，少部分可以被小肠消化吸收。当丁酸以甘油单酯，二甘油酯或三丁酸甘油酯形式添加时，必须从甘油中释放出来才能促进瘤胃上皮的发育。

日粮丁酸补饲的效果可以通过保护丁酸在胃中的释放和利用来调节。通常采用微囊化和脂肪包衣来达到此目的［41-42］。当丁酸以保护形式添加时，仅在瘤胃中部分释放，大多数活性物质在小肠中逐渐释放［43］。当以无保护形式补饲时，丁酸被胃肠道近端部分的上皮细胞迅速吸收，并且不能在血液和近端小肠的内容物中检测到［44］。

2.2.3 日粮丁酸的补饲方式 犊牛的瘤胃发育在很大程度上取决于营养因素，初生犊牛提前饲喂固体饲料可加速其生长，这在早期断奶干预中尤为重要［45］。自由采食固体饲料对犊牛瘤胃的重量，体积和功能的发育有积极影响［46］。此外，从反刍动物刚出生开始就摄入固体饲料会增加犊牛对固体饲料的摄入量，并且可能对瘤胃微生物区系，瘤胃发酵及其瘤胃上皮的形成产生积极影响［47］。瘤胃中的发酵产物，例如VFA（主要是丁酸和少量的丙酸），是瘤胃上皮细胞发育的主要刺激物［28］。液态饲料（初乳，牛奶或代乳品）是幼龄反刍动物最重要的营养来源。因此，实践中给犊牛饲喂数量有限的液态奶和含碳水化合物饲料的混合物，这些混合物迅速发酵成丁酸和丙酸，以加速瘤胃发育［48］。羔羊从2月龄开始采食固体饲料，这种饲料经瘤胃微生物发酵产生VFA。幼龄反刍动物出生时，瘤胃上皮细胞以相似的速率氧化葡萄糖和丁酸。在断奶时（42-56日龄）葡萄糖氧化速率降低，丁酸变成主要的氧化底物［30］。此外，在断奶时，使丁酸生成酮体β-羟基丁酸的瘤胃上皮细胞增加了六倍［30］。有研究表明，在犊牛断奶前后的饲粮中添加丁酸钠可使断奶犊牛瘤胃乳头的长度和宽度有效增加，肌层厚度也有增加趋势［30］。在幼龄反刍动物代乳料或开食料中添加丁酸会有缺点，即瘤胃上皮细胞强烈增殖，特别是分化和成熟导致角质层增厚，瘤胃角化过度会影响瘤胃上皮对VFA的吸收［49-50］。此外，研究表明，日粮添加丁酸会降低绵羊瘤胃食糜中的纤维素分解酶和木聚糖分解酶的活性，而瘤胃中的淀粉分解酶活性较高［51］。无论是在代乳料还是在开食料中直接添加丁酸，其特殊的腐臭味会降低反刍动物的采食量以及平均日增重［52-53］。采用包被形式的丁酸比单一添加丁酸时经济成本高。同时，也有研究表明，使用瘤胃瘘管动物，直接往其瘤胃内灌服丁酸也可促进瘤胃的发育［54］，但此法对反刍动物机体产生应激。Liu等［55］发现饲喂母乳的条件下补饲开食料，同时采用口腔灌服丁酸钠的形式对幼龄反刍动物伤害相对较小，更能反映丁酸对幼龄反刍动物的实际作用，并且更加贴近于生产。

2.3 丁酸对瘤胃上皮发育的影响

丁酸调控幼龄反刍动物瘤胃上皮发育是一个历久弥新的话题。早期研究主要从宏观层面阐述了丁酸对幼龄反刍动物瘤胃发育的影响。Sander等和Hodson［56-57］通过瘤胃瘘管给犊牛灌注乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、氯化钠和葡萄糖发现，丁酸钠和丙酸钠刺激瘤胃乳头生长的能力比乙酸钠、氯化钠和葡萄糖的强。添加丁酸钠能明显促进瘤胃黏膜的发育，瘤胃乳头的生长可能与瘤胃壁代谢丁酸供能直接相关。Walker等［58］也发现，短链脂肪酸能促进瘤胃乳头生长并能产生一定的生化作用，但在7周龄和9周龄断奶羔羊中瘤胃发育迟缓，丁酸利用率下降。Flatt等［59］研究表明，低纤维日粮或乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的混合钠盐溶液都会促进瘤胃乳头的发育。进一步研究发现，在饲喂犊牛的乳糖溶液中添加丁酸钠可增加瘤胃乳头长度［60］。在犊牛代乳料中添加丁酸钠刺激瘤胃发育，增加了乳头长度与宽度，并发现在代乳料与发酵剂混合物日粮中添加丁酸钠，更有利于犊牛的瘤胃上皮发育［4］。同时，在代乳料中添加丁酸钠还可促进瘤胃上皮对丁酸，丙酸和乙酸的吸收代谢，增加瘤胃乳头的长度及宽度［61-62］。在犊牛开食料中添加0.3%的丁酸钠也可有效增加瘤胃乳头长度和宽度，促进瘤胃上皮发育［47］。上述早期研究结果表明，在代乳料/开食料中添加或是通过瘤胃灌注适量丁酸可有效促进幼龄反刍动物瘤胃上皮形态发育并促进其吸收代谢功能。

随着研究的深入，丁酸调控瘤胃上皮发育的研究逐渐从宏观层面延展到细胞和分子水平。Mentschel等［63］研究发现，日粮中添加丁酸刺激瘤胃黏膜基底层干细胞细胞的有丝分裂，进而促进细胞的增殖，使乳头长度增加。Sakata等［64］也证实了这一观点，短链脂肪酸是消化道的生理腔内营养因子，可以促进瘤胃上皮细胞的分裂。体外细胞培养试验发现，丁酸和胰岛素相互作用能促进瘤胃上皮细胞 DNA 合成［65］。Gálfi等［66］发现丁酸抑制瘤胃上皮细胞分化作用是依赖pH变化的过程，因为瘤胃上皮细胞在不同pH值下的代谢和运输过程不断变化，加上局部生长因子，可废除丁酸的抑制作用。进一步研究表明，丁酸钠对瘤胃上皮细胞生长具有浓度依赖性的抑制作用［67］。将较高浓度（5 mmo/L）的丁酸钠添加到瘤胃上皮细胞培养物中，促进了角质化细胞的形成，表明高浓度的丁酸在诱发瘤胃上皮细胞过度角质化中起重要作用［68］。在体试验也进一步证实了这一观点，长期瘤胃灌注高浓度的丁酸会导致瘤胃上皮角质层增厚，细胞增殖减少［69］。Jamila等［70］每天给山羊瘤胃内灌注0.3 g/kg体重的丁酸钠，结果发现瘤胃上皮层的乳头大小增加，这与产生较高的细胞层数目有关，并且细胞周期蛋白与mRNA表达水平增加。研究表明，丁酸通过改善瘤胃上皮细胞增殖和凋亡相关的基因表达促进瘤胃乳头生长。在上皮细胞生长过程中，细胞增殖速度明显高于细胞凋亡速度。Liu等［55］研究发现，口服丁酸钠可以改善断奶羔羊的动物生产性能，促进瘤胃乳头生长，并增强与瘤胃上皮VFA摄取和代谢相关的基因的表达。丁酸可以刺激微生物发酵产物的吸收和代谢，调节参与维持细胞内稳态的蛋白质的活性，以及参与调控瘤胃上皮组织内代谢物的细胞间流动的蛋白质的活性，这些作用促进了瘤胃上皮组织的代谢发育［71］。

丁酸不仅是瘤胃上皮细胞的主要能量来源，而且还是间接刺激上皮细胞增殖的信号分子［54］。丁酸可以通过内分泌和旁分泌的方式来发挥作用，影响激素和生长因子如IGF-1的分泌，进一步促进上皮细胞增殖［9，72］。有研究表明，饲喂非常低水平的丁酸也可促进幼龄反刍动物的瘤胃上皮发育［73-74］，因此丁酸对瘤胃上皮生长和成熟的影响可能更多地依赖于生长因子的间接作用模式而不是直接为细胞增殖提供能量。IGF-1通过信号转导途径加速细胞有丝分裂，细胞周期运转，促进瘤胃上皮细胞增殖分化以及表面积增加［75］。大量研究表明，体外试验注射不同的IGF-1的浓度会改变瘤胃乳头的数量和大小，DNA的合成也会发生变化［76］。有研究发现，IGF-1和丁酸可通过协同作用显著促进DNA的合成和增殖，因此IGF-1和丁酸对瘤胃上皮细胞的生长具有协同促进作用［77］。

3 小结与展望

丁酸作为反刍动物瘤胃微生物降解植物性饲料的主要产物，也是瘤胃上皮及宿主重要的能量来源。本文主要介绍了幼龄反刍动物瘤胃上皮生长发育特点以及丁酸对其发育的影响。开食料/代乳料添加或是口腔/瘤胃灌注合适浓度的丁酸能促进幼龄反刍动物瘤胃上皮发育，主要表现为瘤胃乳头的增长和细胞层的增厚，该过程与瘤胃上皮细胞增殖的加速密切相关。但是过高浓度的丁酸反而对瘤胃上皮的发育产生不利影响，主要表现为瘤胃上皮的过度角质化。所以真正明晰不同幼龄反刍动物（犊牛或羔羊）在不同生理阶段对丁酸的需求量将是未来的研究重点。同时，丁酸促进瘤胃上皮发育的深层机理尚不清楚，还有待进一步探索。