瘤胃微生物与宿主互作及其日粮调控研究进展

2020-02-22王炳罗海玲

生物技术通报 2020年2期

王炳罗海玲

（中国农业大学动物科学技术学院动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

瘤胃微生物对反刍动物的生产效率和健康起着至关重要的作用，并影响动物粪尿以及甲烷等温室气体的排放。同时，瘤胃微生物组成受到环境、动物品种、营养和不同管理策略等因素的影响［1-2］。近年来，宿主反刍动物与其栖息瘤胃微生物群之间的复杂关系一直是研究的焦点。瘤胃酸中毒是我们常见的由日粮营养变化引起的瘤胃微生物菌群紊乱的营养代谢疾病，瘤胃微生物群紊乱导致瘤胃代谢出现异常，进而诱发瘤胃内环境稳态失衡及炎症发生［2］。另外，瘤胃微生物群变化与甲烷温室气体排放间存在密切关系，因此，对瘤胃微生物群落进行调控不仅改善自然环境，也可以改变动物机体的能量代谢，提高动物对饲料的利用效率［2］。目前，人们越来越关注生产高效健康动物畜产品（肉类和乳制品）动物的瘤胃微生物群落，以及宿主基因对瘤胃微生物群落的影响［3］。在瘤胃微生物研究的生物技术方面，以往的研究重点是通过对单个菌株对宿主的功能贡献，来确定瘤胃内该菌的功能，而缺乏对整体瘤胃微生物群的认知。随着生物信息学技术的发展和组学技术的利用，如利用核酸测序（宏基因组学和宏转录组学）、蛋白质组学和代谢组学等技术开展了越来越多针对瘤胃微生物群及功能的分析，极大地提高了我们对瘤胃微生物群落组成及功能的认知。近年来，反刍动物瘤胃内环境营养调控技术发展迅速，特别是在日粮调控作用机理以及营养调控作用下瘤胃微生态与宿主关系方面的研究，取得了许多重要的研究成果。然而，到目前为止，瘤胃微生物群落以及其具体微生特定功能还未清楚解析［4］。因此，本文对瘤胃微生物与宿主关系及其营养调控方面的作用进行综述，旨在促进反刍动物健康高效生产。酶（Volatile fatty acid，VFA）（特别是乙酸、丁酸）和H2［11］。原虫群落分为4类：A型群落，以纤毛虫Polyplastron multivesiculatum为重点种；B型群落，以前毛虫Epidinium ecaudatum和Eudiplodinium maggii为重点种；O型群落，由内毛虫（Entodinium）和厚毛虫（Dasytricha）等毛虫（Isotricha）属组成及K型群落，在牛的瘤胃中特有，其中内毛虫Elytroplastron bubali是关键物种［13］。前期研究显示，在瘤胃微生物群落中，内毛虫（Entodinium）和前毛虫（Epidinium）群落占优势，占总原虫序列数据的54.7%［14］。Kittelmann 等［13］发现在鹿和绵羊瘤胃中的纤毛虫中，优势属为前毛虫（Epidinium）和双毛虫（Eudiplodinium，占总纤毛虫的80%以上）；而在牛瘤胃中，优势属为介形虫（Ostracoda，占纤毛虫总量的81%-86%）和Polyplastron（占纤毛虫总量的7%-11%）。其他观察到的原虫属有内毛虫属、无甲亚-双毛虫属、厚毛虫属和等毛虫属［13］。然而，与显微计数相比，利用焦磷酸测序技术获得的原虫数量（如前毛虫Epidinium或Polyplastron）往往过高［12］，这可能是由于纤毛虫物种间以及物种内的rDNA拷贝数差异增加了基于rDNA测序方法测定环境样品中微生物真核细胞的相对丰度的难度［15］。瘤胃古菌主要序列为广古菌门（Euryarchaeota），超过90%的古菌序列为产甲烷属——甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）［4］。瘤胃功能真菌属主要含有Neocallimastix、Piromyces，Anaeromyces、Caecomyces、Orpinomyces和Cyllamy-ces［4］。

1 瘤胃微生物群落组成

瘤胃微生物群由细菌、原虫、真菌和古生菌组成，它们以共生、竞争、捕食、拮抗等关系存在，共同负责瘤胃中的微生物发酵［5］。反刍动物瘤胃内具有一个复杂的微生物群落，每毫升瘤胃液中包含约1010个细菌［5-6］，已报道的细菌群落分类超过450个［7］，另外还有 107个古细菌，108个原虫和103个真菌［8］。瘤胃微生物群落组成受到反刍动物物种、营养水平、瘤胃内生态位等因素影响，这些因素决定瘤胃中优势群落的组成［4］。一般来说，牛瘤胃细菌中主要以厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主。奶牛瘤胃中的主要细菌属为普雷沃氏菌（Prevotella）、丁酸弧菌（Butyrivibrio）、瘤胃球菌（Ruminococcus）和琥珀酸丝状杆菌（Succinoclasticum）等［4］，而低丰度门水平（小于总细菌群落的1%）细菌群落有螺旋体门（Spirochaetes）、纤维菌门（Fibrobacteres）、浮霉菌门（Planctomycetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）等［4，9-10］。

原虫可占瘤胃微生物生物量的50%［11］。虽然反刍动物可以在没有瘤胃原虫的情况下生活（驱除原虫），但原虫在瘤胃生态系统中起着关键作用，它们与古细菌共生，吞噬有机质颗粒和细菌［12］。原虫在纤维、碳水化合物、蛋白质和脂质消化中起到积极作用，其更倾向于消化纤维来产生挥发性脂肪

2 瘤胃微生物与宿主基因组

越来越多的研究结果表明，胃肠道微生物群落是宿主健康和胃肠道内环境稳态的关键因素［16］。胃肠道微生物菌群的失调导致多种影响宿主生长和代谢疾病的发生。部分研究发现，胃肠道微生物群对宿主的影响可以通过发酵碳水化合物来释放短链脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFA）实现，SCFA是细菌的主要代谢产物［17］。Jiao等［18］研究表明，高精料日粮提高瘤胃Synergistetes、Prevotella、Fibrobacter、Clostridium和Treponema的丰度，降低Candidatus Arthromitus的相对丰度，这些微生物与下调的宿主编码抗菌和补体通路的基因以及上调编码细胞因子信号的基因存在显著相关性，最终影响宿主代谢并导致回肠局部炎症。反刍动物与瘤胃微生物有共生关系，使瘤胃微生物能有效地将复杂的植物源化合物降解成较小的可消化化合物，这一过程与宿主的饲料利用效率有关，在此过程中产生的小分子代谢物可被宿主吸收并被宿主酶转化为其他化合物［19］。Shen等［20］研究发现，瘤胃微生物源性SCFA对上皮细胞生长和代谢的影响是由G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor，GPR）和组蛋白脱乙酰基酶（Histone deacetylase，HDAC）调控网络介导的。Lin等［21］研究表明，饲喂开始料的羔羊瘤胃中主要富集了产乙酸的Mitsokellaspp、产乳酸的Sharpeaspp、乳酸利用相关的巨型球菌Megasphaeraspp.和内毛虫Entodiniumspp.。饲喂开食料羔羊瘤胃上皮中的糖降解相关基因丰度降低，但编码α-淀粉酶的GH13明显增加。瘤胃上皮转录组分析显示，与细胞生长相关的7个差异表达基因，包括MAPK1、PIK3CB、TNFSF10、ITGA6、SNAI2、SAv1和DLG被上调，对细胞凋亡起促进作用的BAD被下调。相关性分析显示，瘤胃乙酸和丁酸浓度的增加与这些基因的表达显著相关，这表明乙酸和丁酸可能是瘤胃微生物群落与宿主互作的重要驱动因素。

3 瘤胃微生物与宿主动物生产

目前，关于瘤胃微生物变化对动物生产的影响，目前主要进行的是动物生产或动物产品品质与瘤胃微生物菌群之间的相关性分析，而针对动物生产或动物产品品质与瘤胃微生物群落之间的因果关系鲜有报道。日粮变化是外因，而瘤胃微生物层面的变化可能是决定日粮等因素作用效果的内在重要因素。反刍动物与瘤胃微生物群存在共生关系，微生物酶降解大多数动物源性消化酶无法消化的复杂多糖［22］。研究发现，某些细菌群落与反刍动物饲料利用效率之间存在联系［23-24］。提高饲料利用效率可以减少动物对环境的负面影响，并且提高经济效益［25］。因此，调控瘤胃微生物群落可以改善动物生产。

瘤胃中微生物生长需要结构性碳水化合物、非纤维碳水化合物和蛋白质，但不需要补充脂肪酸，因为微生物可以合成脂肪酸［26］。高浓度的多不饱和脂肪酸对瘤胃微生物有毒，因为多不饱和脂肪酸与瘤胃微生物的细胞壁形成复合物并干扰瘤胃发酵［27］。日粮中多不饱和脂肪酸和淀粉的含量较高会改变生物氢化通路进而导致乳脂肪合成抑制［28］。有报道显示，通过日粮因素诱发的乳脂肪合成抑制后，瘤胃中瘤胃拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对序列丰度降低，厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）的相对序列丰度增加。在属水平上，未分类的毛螺菌（Lachnospiraceae），丁酸弧菌（Butyrivibrio），Bulleidia和红蝽菌（Coriobacteriaceae）的相对丰度在与乳脂中trans-10、cis-12 共轭亚油酸和trans-10异构体呈正相关，表明它们在生物加氢反应中具有潜在作用［29］。因此，牛奶脂肪酸组成差异主要是由于日粮变化引起的瘤胃微生物变化所导致的［29］。

另外，有研究发现不同乳蛋白产量的奶牛瘤胃细菌多样性和细菌类群丰度存在显著差异。高乳蛋白产量的奶牛瘤胃中梭状芽孢杆菌（Clostridium）和琥珀酸杆菌（Succinivibrio）的相对丰富度低于低乳蛋白产量奶牛，而高乳蛋白产量奶牛中瘤胃未分类琥珀酸杆菌（Succinivibrionaceae）和夏普菌（Sharpea）的相对丰富度高于低乳蛋白产量奶牛。然而，研究发现微生物群组成的差异可能不会直接导致奶牛乳蛋白合成发生改变［30］。因此，在今后研究中需要利用更多的生物学技术如宏基因组和宏转录组学等来确定瘤胃微生物群落及其代谢与动物生产之间的内在关系［30］。

4 日粮调控与瘤胃微生物

在反刍动物生产中，通过日粮措施来调控瘤胃微生物发酵进而影响动物生产和健康的有效措施有很多，而关键的有效措施主要为调节日粮配置（精粗比、饲料原料类型、营养素含量等），或者添加抗生素、益生素益生元、植物次生代谢物、离子元素等。随着生物技术的发展，特别是多组学技术在动物营养和饲料科学领域的运用（如Feedomics理论），可以解释外源日粮等添加物因素的特有相关微生物及代谢物，这有助于揭示出日粮等因素调控反刍动物瘤胃代谢及生产的作用机理［31］。

4.1 日粮原料及营养配置

日粮饲料原料类型及营养成分（如纤维素、蛋白质、脂质和淀粉）的变化可以显著改变瘤胃微生物群落的组成［32］。这是因为大多数反刍动物饲料都是由复杂的聚合物成分组成，没有任何一种单一微生物能够完全降解饲料的聚合物成分，这些饲料中的聚合物成分都是需要一个复杂的瘤胃微生物区系以及微生物种群之间的合作来分解［33］。通过日粮调控措施可以改变瘤胃微生物群落，进而优化瘤胃功能［34］。日粮与微生物成分之间的互作可以调节胃肠道的屏障功能［35］。而粗饲料类型的改变可以显著改变优势菌群的种类，例如，Pitta等［32］研究证实用全株小麦替代百慕大干草到可以改变肉牛瘤胃细菌的组成和多样性，在饲喂小麦的肉牛中观察到普雷沃菌的相对丰度升高，从而表明饲喂全株小麦可以通过增加瘤胃普雷沃菌的丰度来提高肉牛瘤胃降解蛋白质的能力［36］。高纤维日粮下的宿主-微生物互作关系可以影响动物生产效率，表明不同日粮变化可以调控瘤胃微生物进而影响动物生产［37］。

通过日粮配置可以调控瘤胃产甲烷菌数量和组成，进而影响瘤胃甲烷生成，其主要措施有：增加精饲料的比例和添加饲料添加剂（如硝酸盐）等。如果通过日粮调控来降低甲烷排放的作用效果与反刍动物自身的特定因素有关，如采食量或反刍动物生理，则该日粮因素在不同类型反刍动物中的有效性是不同的；而如果日粮调控的作用效果与产甲烷的发酵通路相关，则在不同类型反刍动物间的有效性是相同的。这主要是由于不同类型反刍动物的消化生理状态是完全不同的（如关于日粮的消化时间，饲料消化率，消化和发酵特性）。Van Gastelen等［38］综述表明，饲喂更易消化的草（牧草或青贮饲料）或用玉米青贮饲料替代其他类型粗饲料可以降低瘤胃甲烷排放，其作用效果在奶牛上最有效，对肉牛有一定效果，但对绵羊影响很小。研究发现高谷物日粮虽然会降低产甲烷菌数量以及甲烷的排放，但是对瘤胃微生物群结构和功能会产生不利影响，进而影响动物健康和生产［39］。另外，反刍动物日粮中通过添加脂质可以调节反刍动物瘤胃微生物区系，进而减少甲烷排放［40］。因此，可以通过调控日粮来降低反刍动物甲烷排放，但日粮调控措施在不同类型反刍动物之间甲烷排放的有效性需要基于每种动物各自的特性展开研究［38］。

4.2 抗生素

抗生素主要用于反刍动物的疾病预防和促生长，因此，在现阶段许多国家的畜牧业生产中，仍经常使用抗生素。抗生素的长期使用易造成胃肠道微生物菌群紊乱，进而导致宿主受感染和诱发疾病［41］。大量证据表明，抗生素的使用可快速导致胃肠道微生物群落减少［42］。抗生素的使用可导致山羊瘤胃微生物群的结构变化，并抑制瘤胃微生物群落的功能［43］。瘤胃微生物群落的变化模式取决于抗生素的类型［44］。停用抗生素后，胃肠道微生物群可以在几天到几周内恢复［45］。然而，恢复后的微生物群的组成通常与未使用抗生素前的状态不同［42］。此外，抗生素诱导的胃肠道微生物群的改变可能对宿主的健康和生理功能产生更加深远的负面影响。例如，抗生素诱导的儿童胃肠道微生物群落的改变与慢性疾病的出现有关，如哮喘等人类特应性疾病［45］。莫能菌素导致奶牛瘤胃拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度显着降低，提高红蝽菌科、普氏菌、蓝藻细菌、毛螺菌科和疣微菌的相对丰度［46］。然而，抗生素使用对瘤胃微生物群落的形态及发酵功能的影响结果仍较少。因此，需要更多研究关注抗生素使用对瘤胃微生物的影响。

4.3 益生菌和益生元

益生菌定义为可以直接饲喂的微生物（活的有益微生物），通常用作饲料添加剂，并作为亚治疗性抗生素的替代品，来维护机体健康并预防细菌感染［47］。反刍动物中使用最广泛的益生菌补充剂包括乳酸杆菌和酵母菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、肠球菌、丙酸杆菌、埃氏巨型球菌（Megasphaeraelsdenii）和普雷沃特菌（Prevotellabryanti species）［48-49］。近些年来，集约化畜牧业生产的快速发展导致动物日粮中高谷物饲料饲喂过多，而高精料的饲喂容易导致反刍动物瘤胃酸中毒，并诱发一系列营养代谢疾病［50］。益生菌益生元等日粮添加剂可能有助于减轻高精料日粮等日粮配置不合理所产生的不利影响，从而改善动物健康和生产力［51-52］。研究证明，选择合适的剂量来饲喂奶牛M. Elstenii菌株有助于降低瘤胃酸中毒的患病率［53］。

宿主对益生菌的响应高度依赖于益生菌菌株、年龄、品种和其他日粮特性等因素［54］。抗菌化合物的产生可能是益生菌抗菌活性的主要机制，另外，益生菌黏附到上皮细胞、竞争营养素和调节免疫系统也是其部分作用机制［55］。一些益生菌菌株产生一些诸如有机酸和抗菌化合物类的代谢产物，它们可以刺激微生物生长，抑制潜在病原体［56］。也有一些益生菌可以通过消耗氧气来帮助建立瘤胃中的关键微生物群（普雷沃氏菌、类杆菌真杆菌和梭状芽孢杆菌）［57］。益生菌在提高饲料转化率、增重和产奶方面发挥着重要作用［58-59］，在奶牛日粮中加入一些益生菌可以通过直接产生消化酶来改善瘤胃生态系统，促进有益微生物群的生长和功能，从而形成稳定的瘤胃微生物生态系统［55］。益生菌有助于调节肠道微生物的体内平衡［59］，降低新生犊牛腹泻的频率［60］，调节瘤胃的酸碱度［61］，刺激免疫力［55］。益生菌通过诱导局部和全身细胞因子的产生，如白细胞介素18、白细胞介素12、TLR2和肿瘤坏死因α，并激活多细胞信号通路来影响机体免疫系统［58］。益生菌也可以通过与宿主微生物种群的相互作用抑制其他潜在致病菌的生长［55］。

活酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有平衡瘤胃生态系统的功能，饲喂酵母可以提高反刍动物对高比例粗饲料的消化率，提高低质粗饲料的使用比例。因此，活酵母成为畜牧生产中广泛应用的高效益生菌之一［58］。活酵母细胞有潜力在瘤胃中发挥双重益生菌活性作用。酵母的益生菌作用可以通过调节瘤胃微生物种群和活性来实现，从而降低乳酸含量，增加和维持瘤胃的pH值，提高营养消化率，优化VFA，并减少瘤胃氨态氮生成［52］。酵母的另一个积极作用是改变瘤胃发酵以减少甲烷产量，从而减少发酵过程中的能量损失［62］。此外，直接饲喂的酵母通过酵母细胞中的低聚糖、氨基酸、维生素和有机酸等化合物来引发益生元效应，可以刺激瘤胃微生物群落生长，提高瘤胃对日粮的利用效率。在动物发育早期，酿酒酵母的饲喂可显著改善瘤胃微生态，主要作用机制是增加了瘤胃微生物蛋白并降低瘤胃普氏菌丰度，增加了瘤胃丁酸和总VFA浓度［63］。酿酒酵母也可以促进瘤胃中的纤维消化［64］。然而，前期研究比较不同酵母菌株（酿酒酵母、热带假丝酵母和实用假丝酵母）对玉米秸秆和稻草体外瘤胃消化的影响，结果显示热带假丝酵母是唯一一种能促进秸秆干物质和中性洗涤纤维的瘤胃降解率、降低甲烷产量、改善瘤胃发酵效果的菌株［52］。除了酵母以外，北美野牛瘤胃中羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的活性可随着厌氧真菌的饲喂而增加，从而提高饲料粗蛋白和纤维素的消化率［65］。

另外，酿酒酵母培养物作为饲料添加剂的使用，可以刺激乳酸菌的生长，提高产奶量［66］、瘤胃VFA浓度和瘤胃pH值［67］，有利于各种类型的瘤胃微生物种群［68］，改善瘤胃代谢［58］。日粮中补充酿酒酵母培养物可降低生长期山羊瘤胃氨浓度和减少甲烷排放，但是，并未改变瘤胃产甲烷菌的相对丰度［69］。此外，向哺乳期荷斯坦奶牛中添加酿酒酵母培养物可以改善瘤胃消化功能［70］。

到目前为止，益生菌对微生物群落组成的确切影响结果尚不清晰，需要进一步研究充分明确益生菌等直接可饲喂的微生物对瘤胃微生物群落的影响及其本身在瘤胃中定殖情况及其与宿主健康和生产的关系。

4.4 植物次生代谢物

一直以来，营养学家一直认为植物次生代谢物（单宁、黄酮类和皂苷类）是抗营养因子，因为它们对饲料摄入、营养素利用、动物生产和健康都有不利影响［71］。然而，在牛、绵羊和山羊进行的大量体内和体外的近期研究结果发现，日粮中加入适量的植物次级代谢产物，可以改善饲料的利用效率。植物次级代谢产物通过加强瘤胃发酵、减少产甲烷菌的数量来减少日粮蛋白质降解并促进瘤胃微生物蛋白质的合成，进而提高动物的生产性能［72］。

多酚能通过扰动瘤胃微生物群落组成抑制或调节不饱和脂肪酸的生物加氢作用，浓缩单宁对生物加氢有抑制作用，而水解单宁对生物加氢有调节作用。多酚对革兰氏阳性纤维溶解菌和纤毛原虫的一般起抑制作用，从而导致VFA产生减少（主要是乙酸产量）。水解单宁可以通过直接与瘤胃微生物群相互作用而不影响纤维消化来减少甲烷排放［73］。

另外，有研究发现山羊日粮中补充富含植物活性物质（内酯、黄酮、甾醇类物质）的穿心莲（Andrographis paniculata）叶可以提高瘤胃中白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus），黄色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）和产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）的数量，进而提高日粮消化率［74］。Lei等［75］利用宏基因组数据分析发现饲料中添加植物精油-钴（EOS）后，拟杆菌（Bacteroidesspp.）和琥珀酸弧菌（Succinivibriosp.）群落的变化与VFA生成有关。EOS可作为一种有前景的天然植物活性物质，用来降低瘤胃甲烷和氨气的生成，改善瘤胃发酵，从而减少反刍动物生产对环境的影响。Wang等［76］研究发现，6月龄左右青年公牛日粮中补充适量皂苷可以显著提高瘤胃普雷沃氏菌Prevotellaceae_YAB2003，但是降低瘤胃球菌Ruminococcaceae_NK4A214和毛螺旋菌Lachnospiraceae_NK3A20的丰度，并且提示皂苷可以通过调控瘤胃菌群来改变瘤胃代谢功能进而影响动物生产，因此，这些菌被认定为潜在的皂苷功能相关菌。然而，到目前为止，关于植物次生代谢物的特有瘤胃功能相关菌方面的研究仍然较少，需要更多研究来揭示具有有效调控瘤胃健康以及代谢的功能性植物次生代谢物的瘤胃微生物菌群信息。

4.5 离子元素

有研究发现，在山羊日粮中补充镁可以增加瘤胃的H2浓度，抑制瘤胃发酵，增强产甲烷能力，其潜在机制是将发酵途径从乙酸生成转变为丙酸生成途径，并通过减少真菌和增加产甲烷菌改变微生物群落［77］。随着硝酸盐添加水平提高，Methanosphaera和Methanimicrococcus丰度线性增加，而Methanoplanus丰度线性下降［78］。小公牛日粮中添加碳酸氢钠可以提高瘤胃微生物多样性，降低链球菌（Streptococcus）和丁酸弧菌（Butyrivibrio）的相对丰度，增加瘤胃球菌属（Ruminococcus），琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）和Prevotella的比例［79］。然而，关于通过日粮中补充离子元素来调控瘤胃微生物群落以及瘤胃代谢的研究较为缺乏，并且缺乏针对离子元素调控瘤胃微生物群落及功能的机理性探讨。利用最新的生物技术手段（多组学、高通量测序及纯培养技术），可以区分特定瘤胃微生物的位置，确定种群多样性，并探索微生物群与宿主之间的关系。展望未来，随着测序技术的不断进步和对瘤胃微生物群的系统发育和功能能力的深入探究，通过日粮营养改变、益生菌和益生元以及植物活性物质等外源性添加物的调控，将提出更有效的日粮策略来调控瘤胃微生物群。更多进行瘤胃细菌和古细菌的纯培养研究，并且，了解微生物结构，微生物群利用的底物以及微生物群落间如何相互作用，以更好地研究瘤胃微生物群的功能。此外，为了更好地了解宿主与微生物相互作用在动物生产和疫病中的作用，需要更多应用宏转录组学、宏蛋白组学和代谢组学的研究，从而减少抗生素的不合理使用，确保生产出符合全球需求的优质畜产品。