基于“调气血,和阴阳”探析逆针灸对高血压家族史大学生非杓型血压昼夜节律的影响※
2020-02-22王艳君兰向东庞国明何红涛计彦新张文明安向平
王艳君 石 芳 兰向东 庞国明 何 立 何红涛 计彦新 张文明 安向平
(河北中医学院附属医院针灸科,河北 石家庄 050011)
昼夜节律是一种接近24 h(19~28 h)的生物周期[1],能够使机体功能适应日常环境变化。人体的心血管、内分泌等系统均存在昼夜节律变化,若昼夜节律紊乱则会导致这些系统功能障碍,增加罹患心脑血管疾病、肥胖、糖尿病等慢性疾病的风险[2-3]。以血压昼夜节律为例,人体血压24 h的波动节律即为血压昼夜节律,呈现“双峰一谷”的“长柄杓”形曲线,具有益于适应机体活动、保护靶器官等功能,而紊乱的血压昼夜节律是独立于血压水平的重要致病因素,对靶器官损害更为严重[4]。因此寻求调节血压昼夜节律方法尤为重要。研究表明,针刺能够治疗非杓型高血压,可以起到降压和调节律的双重效应[5]。目前针刺的降压疗效确切,但其调节血压昼夜节律的作用机制尚不明确。同时有研究表明,新陈代谢和昼夜节律紧密相关,昼夜节律在调节能量稳态方面起关键作用,而脂质则是涉及系统能量代谢和体内平衡的主要介质[6]。故本研究基于“调气血,和阴阳”探析逆针灸对大学生非杓型血压昼夜节律的调节作用,探究针刺是否可以逆转紊乱的昼夜节律及可能机制,旨在为今后临床针刺调节血压节律提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象 本课题组前期以216名血压正常的健康大学生作为观察对象,进行24 h动态血压监测和体质问卷调查,结果显示47名大学生有高血压家族史,其中30例学生的血压昼夜节律为非杓型,17例为杓型,表明高血压家族史与血压昼夜节律之间存在相关性,具有高血压家族史的健康大学生血压昼夜节律为非杓型的可能性较大。本研究选取前期研究中具有高血压家族史的非杓型健康大学生30例作为研究对象,其中男7例,女23例;年龄20~28岁,平均(23.6±1.4)岁;体质量47.5~76 kg,平均(57.89±7.84)kg;身高155~184 cm,平均(165.34±12.17)cm。研究流程中针刺治疗、数据采集和数据分析分别由专人负责。
1.2 纳入、排除、中止试验及脱落标准
1.2.1 纳入标准 ①在校学生,18岁≤年龄≤30岁;②有高血压家族史;③血压在正常范围内;④血压昼夜节律为非杓型;⑤患者自愿接受本治疗,签署知情同意书;⑥本研究方案获得河北中医学院第一附属医院伦理委员会批准,批准编号为20150918-1。
1.2.2 排除标准 ①原发性高血压或继发性高血压患者;②合并有心、脑、肝、肾和造血系统等严重原发疾病,精神病患者,呼吸睡眠暂停综合征;③正在参加其他可能影响本研究结果评价的受试者。
1.2.3 中止试验及脱落标准 ①患者依存性较低,未按疗程进行治疗,或研究期间自行退出者;②服用影响血压及其节律的药物,而干扰结果者;③受试者出现严重并发症或危急情况,不适宜继续治疗者。
1.3 治疗方法 全部受试者均予针刺治疗。取穴:曲池(双)、足三里(双)。定位:曲池,在肘横纹外侧端,屈肘时,当尺泽与肱骨外上髁连线的中点处;足三里,在小腿前外侧,当犊鼻穴下3寸,距胫骨前嵴外一横指(中指),平胫骨粗隆下缘处。操作方法:患者取仰卧位,医生以押手轻触、揉按针刺局部皮肤,揣摩深浅,确定针刺的腧穴,针刺部位皮肤常规以碘伏消毒后,选用0.30 mm×40 mm华佗牌一次性无菌针灸针,以左手轻触固定所针刺的腧穴,右手持针快速刺入皮下。直刺1寸,每穴行小幅度的提插捻转,行平补平泻手法,使局部有热胀感,留针20 min,期间每10 min行针1次,共行针2次。受试者于每日上午7:00~9:00接受治疗,每周连续治疗5 d,休息2 d,共治疗2周。
1.4 观察指标及方法
1.4.1 记录动态血压 ①统一采用ri-cardio型24 h动态血压监测仪(德国里斯特公司)进行24 h动态血压监测,白天(6:00~21:59)每间隔30 min测量血压1次,夜间(22:00~次日5:59)每间隔1 h测量血压1次。记录期间患者日常活动不受限制,嘱患者在监测仪自动测血压时右臂保持静止,监测期间避免剧烈运动。血压监测包括24 h平均收缩压、24 h平均舒张压、白天平均收缩压、白天平均舒张压、夜间平均收缩压、夜间平均舒张压。治疗前1周内和治疗后1周内受试者分别测量1次。②血压昼夜节律:根据动态血压监测结果,计算夜间平均血压下降率=(日间血压均值-夜间血压均值)/日间血压均值×100%。夜间平均血压下降率10%~20%为杓型,<10%为非杓型,<0为反杓型,>20%为超杓型。当夜间平均血压下降率在收缩压与舒张压上表现不一致时,以收缩压为准。
1.4.2 血浆脂质提取 所有受试者在治疗前后均抽取空腹肘静脉血4 mL,采集后血液在室温下凝结30 min,后以3 000 r/min离心15 min。后取血清上清液并保存在-80 ℃环境中备用。将100 μL血浆与900 μL异丙醇混合,涡旋10 s以上,超声10 min,混合物在-20 ℃下冷冻1 h,然后以10 000 r/min离心10 min。收集上层800 μL液体并转移至样品瓶中,以进行注射,并通过高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)法进行分析。
1.4.3 UPLC-Q-TOF/MS分析 质量控制(QC)样品通过汇集所有血清样品的等分试样来制备,所述血清样品代表待分析的血清样品。采集期间,每5个样品注射1次空白样品(异丙醇∶水=90∶10)和质控样品。使用ACQUITY UPLC一级UPLC系统(英国曼彻斯特沃特世公司)与Xevo G2-S Q-TOF电喷雾电离四重飞行时间质谱仪(英国曼彻斯特沃特世公司)耦合,进行UPLC-Q-TOF/MS分析。沃特世ACQUITY UPLC CSH色谱柱[粒度,1.7 μm;50 mm(长)×2.1 mm(内径)]用于液相色谱分离,柱温保持在55 ℃。流速为0.4 mL/min,进样量为2 μL。流动相A为0.1%的脂肪酸和10 mm的甲酸铵(在丙烯腈∶水中为60%∶40%),流动相B为0.1%的脂肪酸和10 mm的甲酸铵(在异丙醇∶丙烯腈中为90%∶10%)。线性梯度设置如下:40% B,0~2 min 40% B to 43% B,2~2.1 min 43% B to 50% B,2.1~12 min 50% B to 54% B,12~12.1 min 54% B to 70% B,12.1~18 min 70% B to 99% B,18~18.1 min 99% B to 40% B,18.1~20 min 40% B。
高精度的质谱数据由MassLynx 4.1软件记录(英国曼彻斯特沃特世公司)。采用Waters-QTOF质谱仪(英国曼彻斯特沃特世公司)独立于数据的MSE扫描方法,可自动获得所有前体离子的高精度一次质谱和二次质谱数据。正负模式的毛细管电压均为3.0 kV,锥形电压均为25 V。源温度设定为120 ℃,锥型气体流量为50 L/h,去溶剂化温度设定为450 ℃,去溶剂化气体流量为850 L/h。亮氨酸-脑啡肽(英国曼彻斯特沃特世公司)被用作锁定物质,在正模式下以m/z 556.2771产生参考离子,在负模式下以m/z 554.2615产生参考离子,该离子是由锁频仪(英国曼彻斯特沃特世公司)以5 μL/min引入的,用于数据校准。均方误差数据是在2个扫描函数中使用斜坡碰撞能量以连续模式获得的。对于低能量模式,扫描范围为50~2 000 Da,扫描时间为0.2 s,碰撞能量为6 V。对于高能量模式,扫描范围为50~2 000 Da,扫描时间为0.2 s,碰撞能量为15~60 V。
1.5 数据处理和统计分析 质谱原始数据经过处理,峰注释和标准化,以及通过数据库搜索进行的脂质鉴定,均由Progenesis QI软件(英国曼彻斯特沃特世公司)完成。分析不同组之间的所有脂质种类,对于每个单独的样品,所有检测到的脂质种类的强度按脂质类别进行汇总。每个脂质类别的相对量以百分比计算。配对样本中各脂质种类的强度采用非参数Wilcoxon符号秩检验(R package) 进行比较,以P<0.05为差异有统计学意义。使用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)完成多变量统计分析,并获得在特征变量投影重要性(VIP)>1的脂质。
2 结 果
2.1 30名受试者针刺前后血压节律改变情况 针刺治疗后,30名受试者中有7名受试者血压昼夜节律由非杓型转为杓型,23名受试者血压节律未改变。见表1。
表1 30名受试者针刺前后血压节律改变情况
2.2 30名受试者针刺前后夜间血压下降率比较 见表2。
表2 夜间血压下降的变化
由表2可见,7名针刺后血压节律转为杓型的受试者与23名治疗后血压节律未变的受试者相比,其夜间收缩压和舒张压均明显下降,但处于正常范围内。
2.3 受试者针刺治疗前后总色谱图比较 针刺治疗前后血清样品的UPLC-Q-TOF/MS图以阳性和阴性模式显示在图1中。治疗前后总体色谱图无明显差异。见图1。
注:针刺治疗前后血清样本的代表性UPLC-Q-TOF/MS图。A:积极模式;B:消极模式。上:针刺治疗前;下:针刺治疗后。
2.4 经过数据过滤后,在最终数据分析中选择了429个变量(脂质峰)(323个峰在ESI+模式,106个峰在ESI-模式),对每个脂质类和亚类的所有检测到的脂质种类的强度进行了汇总。针刺后由非杓型血压转为杓型血压者,其血清中谷氨酸氨基转移酶低于非杓型血压者,而血清甾醇高于非杓型血压者。对亚类的进一步分析表明,杓型血压磷脂酰胆碱明显较低。见图2。
图2 脂质种类的强度汇总
2.5 鉴别杓型血压与非杓型血压的关键脂质的发现与鉴定 见图3,表3。
注:A:OPLS-DA评分图,蓝色的点是以B为代表的针刺前的样本;红点是以A为代表的针刺后的样本。B:OPLS-DA评分S图,红色框内的点是VIP>1的变量。
表3 7名从非杓型血压转为杓型血压受试者针刺前后血清中VIP>1的脂质
由图3A可知,OPLS-DA评分图显示了7名受试者在针刺治疗后由非杓型血压转变为杓型血压,模型具有良好的拟合和预测性能(R2Y=0.99,Q2Y=0.88)。由图3B和表3可知VIP值大于1的变量(脂质种类)被认为在群体分离中起重要作用,共筛选出29种VIP>1的脂质,具有区分杓型血压和非杓型血压的作用。
2.6 受试者针刺前后OPLS-DA评分图比较 见图4。
由图4A可知,当使用OPLS-DA观察23名受试者在针刺治疗前后的组间差异时,这些受试者并未从非杓型血压转变为杓型血压,OPLS-DA评分图仅显示了血脂谱的差异趋势,但不能很好地区分2组(R2Y=0.57,Q2Y=0.37)。由图4B可知,对针刺后血压水平和昼夜节律变为杓型的7名受试者进行了相同的分析作为对照。结果显示配对血清与正常对照组没有分离趋势(R2Y=0.35,Q2Y=0)。
在以上2组中也计算了VIP值。为了减少间接影响血脂谱但与血压夜间下降无关的其他因素的影响,从表2中筛选出图4的OPLS-DA中VIP>1的血脂。严格过滤后,只有4种脂质,即磷脂酰胆碱(20∶4/17∶0)、甘油三酯(18∶1/19∶0/22∶6)、3’-磺基半乳糖凝集素(d18∶1/18∶0)和甘油二酯(16∶0/20∶3)(表3以粗体显示),在区分杓型和非杓型血压方面具有特异性。
注:A:23名受试者针刺前后OPLS-DA评分图;B:7名受试者针刺前后OPLS-DA评分图
2.7 针刺前后非杓型转为杓型7名受试者脂类物质浓度的统计分析 见图5。
由图5可知,用Wilcoxon秩检验法筛选出6种脂类物质PC(20∶4/17∶0)、PC(22∶0/20∶4)、PS(O-18∶2/17∶0)、PS(O-20∶2/17∶0)、DG(16∶0/18∶3)、TG(20∶4/18∶220∶4),在针刺前后比较差异有统计学意义(P<0.05)。在与VIP筛选的4种脂质结合后,只有PC(20∶4/17∶0)被鉴定为能够指示和辨别血压昼夜节律状态的关键脂质种类。
图5 针刺前后7名受试者脂类物质浓度的统计
3 讨 论
昼夜节律广泛存在于人类和其他哺乳动物中,参与调节多种生理、心理和行为变化,是生命活动的本质特性[1]。昼夜节律的中枢位于下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN),且广泛表达于心脏、肾脏、骨骼肌等组织中[7-8]。昼夜节律紊乱会导致睡眠、心血管、代谢等多种功能障碍的发生[2-3]。人体正常血压节律为“两峰一谷”长柄杓状样特征波动模式,夜间收缩压较昼间收缩压下降比率为10%~20%,此种血压波动模式对保证机体各种生理活动及维护心、脑、肾等重要脏器功能十分重要[9]。研究表明,血压昼夜节律异常者伴发心脏、肾脏、血管靶器官损害以及心血管病的风险明显增加[10-12]。而临床研究表明,针刺能显著降低血压,改善昼夜血压节律[13]。阎琦等[14]研究发现针刺人迎穴为主不仅能使血压下降,而且可将非杓型恢复为杓型,并且针刺时间越长,杓型曲线越明显。白桦等[15]证实,百会透刺前顶能够在显著降低昼夜平均收缩压和平均舒张压的基础上,对昼夜血压节律和降低肾素水平产生一定作用。既往研究发现,高血压具有家族聚集性,是高血压患病的独立危险因素[16]。有高血压家族史的患者患高血压的风险是无家族史的2~4倍[17]。同时研究表明,高血压家族史是非杓型血压昼夜节律紊乱的危险因素。本研究以具有高血压家族史的非杓型健康大学生为观察对象,采用“逆针灸”调整阴阳,纠正紊乱的血压昼夜节律。
中医学认为,血压作为人体气血阴阳运行的外在表现之一,其昼夜节律受气血阴阳盛衰规律的影响呈现“双峰一谷”的节律变化。《中藏经》曰:“阳始于子前,末于午后,阴始于午后,末于子前,阴阳盛衰,各有时,更始更末,无有休止。”说明人必须适应自然界的周期性变化,反之则会导致阴阳失调,影响正常的血压昼夜节律[18]。《素问·调经论》言“血气不和,百病乃变化而生”。可见气血紊乱导致脏腑功能失调,引发多种节律紊乱性疾病。故血压昼夜节律紊乱的主要病机是阴阳失调,气血失和。因此,本研究在“调气血,和阴阳”理论的指导下,以“逆针灸”调整人体气血,平衡机体阴阳,实现以平为期的目标。其选穴组方取阳明经穴曲池、足三里进行针刺。阳明经为多气多血之脉,阳明之脉乃二阳合明,主司聚合,有内敛阳气、纳阴蓄血之效。曲池可摄纳阳明气血,使气血下降,平亢盛之肝阳,镇上逆之邪火,有平衡阴阳之功。足三里是胃经合穴,胃之下合穴,有和胃健脾、升降气机、通腑化痰之功用,重在调脏腑气血之平衡。并根据人体昼夜气血流注变化规律和血压“双峰一谷”昼夜节律,于血压晨峰(即辰时,7:00~9:00)为治疗点,选二穴合用,择时针刺,调和气血,改善血压昼夜节律,发挥将非杓型血压昼夜节律转变为杓型的效应。
本研究结果显示,针刺治疗后,30名受试者中7名变为杓型昼夜节律。脂质分析显示,磷脂酰胆碱、甘油三酯、3’-磺基半乳糖凝集素和甘油二酯在针刺治疗前后变化有差异,其中磷脂酰胆碱(20∶4/17∶0)可能是可以区分非杓型血压与杓型血压受试者的关键脂质物种。表明针刺调节血压昼夜节律可能与调节磷脂酰胆碱(20∶4/17∶0)、甘油三酯(18∶1/19∶0/22∶6)、3’-磺基半乳糖凝集素(d18∶1/18∶0)和甘油二酯(16∶0/20∶3)的代谢相关,磷脂酰胆碱(20∶4/17∶0)可能是鉴别杓型和非杓型血压昼夜节律的关键物质。
综上所述,针刺能够逆转具有高血压家族史非杓型血压节律大学生的血压节律,其作用机制可能与调节脂质代谢相关。由于研究样本量较小,治疗周期较短,使得非杓型血压昼夜节律转变为杓型血压昼夜节律的例数较少。今后应当增加样本量,延长干预时间,进一步实现全身性脂质谱的综合表征,探索潜在的生物标志物用于区分杓型和非杓型型血压,为针刺调节血压昼夜节律提供思路,也为针刺治疗其他节律紊乱性疾病提供参考依据。