叠氮化钠氧化法测定生物组织中半胱氨酸含量

张忠义， 曹彦圣， 郑能建， 肖红伟， 罗 笠， 梁 越，朱仁果， 谢亚军， 郭 威， 潘媛媛， 潘春蓉

(1.东华理工大学 江西省大气污染成因与控制重点实验室，江西 南昌 330013；2.东华理工大学 水资源与环境工程学院，江西 南昌 330013)

在全球范围内，人类赖以生存的环境、食物、水体等已经遭受有毒重金属的污染，大部分人暴露于慢性、低水平的重金属污染中(付美云等，2006;赵庆龄,2010; Tchounwou et al.， 2012)。随着我国工业化的快速发展，大量工业废水的排放、含重金属农药化肥的广泛使用及采用污水灌溉等导致我国农田重金属超标等环境问题日趋严重(Li et al.，2014; Cheng, 2003；曹维鹏等，2006)。以汞、镉和铅等为代表的巯基活性重金属生物代谢性非常差，通过食物链的放大和富集作用，其含量往往可以高达环境浓度的数百万倍，严重危害人类健康(Quig, 1998; 张礼等, 2017)。

汞，尤其是其有机形态的甲基汞，具有极强的神经毒性和生殖危害性。普遍认为，饮食(如食用鱼类、水产品和稻米等)是人体甲基汞暴露的主要途径(Lavoie et al.，2013; Schaefer et al.， 2009)。已有研究表明，在生物体对甲基汞的摄取、储存和转运、排泄等过程中，甲基汞主要与含硫氨基酸结合(Clayden et al.，2013; Rao et al.，2014)。例如，甲基汞与谷胱甘肽的结合是其主要的解毒机制，而与半胱氨酸的结合是甲基汞越过血脑屏障的主要方式(Dago et al.，2014; Parvinder et al.，2006; Quig，1998)。同时，环境中无机汞与半胱氨酸结合后甲基化效率明显增加(Chakraborty et al.，2015; Schaefer et al.，2009)。Lemes等(2009)研究发现，角鲨鱼肌肉组织中甲基汞主要以甲基汞-半胱氨酸络合物形态存在。因此测定生物组织内结合态氨基酸尤其是半胱氨酸的含量，有助于深入了解巯基活性重金属的行为(如转运、排泄和生物富集等)。但是在典型的苯酚保护高温酸水解条件下，半胱氨酸极易被破坏，目前国内外该领域的研究中少有含硫氨基酸含量的报道(Manneberg et al.， 1995; Thera et al.， 2017， 2018)。

基于此，本研究采用氧化法对半胱氨酸进行预处理，使用叠氮化钠将半胱氨酸及胱氨酸转化为磺基丙氨酸，通过氨基酸分析仪进行测定进一步解释巯基重金属生物富集行为。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Membrapure A300氨基酸分析仪(德国曼默博尔公司)，配备蠕动泵、阳离子色谱柱、在线脱气系统、自动进样器、柱温箱、紫外检测器以及数据采集和处理系统；Milli-Q超纯水系统。

磺基丙氨酸、胱氨酸和半胱氨酸标准样品(纯度高于99.9%)购买于Sigma-Aldrich公司；18种氨基酸混标为仪器自带标样，除胱氨酸(50 nmol/mL)外，其余氨基酸浓度均为100 nmol/mL。叠氮化钠、盐酸、苯酚等均为分析纯试剂，购买于本地供应商；鱼类样品2016年10月采自于鄱阳湖南湖区域。

1.2 氨基酸分析仪条件

本研究中使用的阳离子色谱柱为德国曼默博尔公司自产色谱柱，批号为T615。采用6组pH不同的流动相对18种氨基酸进行梯度洗脱，6种流动相均为锂盐系列缓冲液。其中流动相A、B、C、D、E的pH分别为2.70、3.19、4.04、7.90、9.90，缓冲液F为0.2 mol/L的氢氧化锂溶液。不同的氨基酸大致根据其等电点依次洗脱，在柱后衍生装置中与茚三酮衍生剂反应，反应生成的氨基酸衍生物在440 nm/570 nm两个波段下分别进行检测。梯度洗脱程序如下：0～24 min，100%流动相A；24～39 min，100%流动相B；39～51 min，100%流动相C；51～56 min，100%流动相D；56～83 min，100%流动相E；83～90 min，100%流动相F。流动相流速始终保持在220 μL/min。柱温箱温度：0～35 min保持在40 ℃；35～60 min缓慢上升到60 ℃；60～90 min缓慢上升到70 ℃。进样体积为20 μL。

1.3 样品前处理

由于叠氮化钠氧化法能同时将胱氨酸和半胱氨酸氧化为磺基丙氨酸，因此半胱氨酸含量通过氧化水解法测定的磺基丙氨酸与典型水解法测定的胱氨酸的差值计算。本研究中氧化水解法步骤为：称取干重样品1.50 mg(精确到小数点后2位)于10 mL水解管中，依次加入6 mol/L盐酸890 μL、1%苯酚溶液10 μL、2%的叠氮化钠溶液100 μL，匀速氮吹5 min；密封后于110 ℃下水解24 h。水解完成后，在70 ℃下连续赶酸3次，最后用0.01 mol/L稀盐酸1 mL定容。

1.4 方法重现性、精密度及回收率实验

配置100 nmol/mL磺基丙氨酸和胱氨酸混合标准溶液，连续进样6次，根据峰面积计算相对标准偏差(RSD)，评估方法的重现性。

将鱼肌肉组织样品按照上述方法平行进行6次实验，根据检测结果计算半胱氨酸RSD，得出方法的精密度。

将适量半胱氨酸及胱氨酸标准品(20，50，100 pmol)置于鱼肌肉组织干样中，按上述方法进行6次样品氧化水解预处理，计算加标回收率。

2 结果与讨论

2.1 氧化方法的选择

目前大部分的研究中，均采用过甲酸氧化方法测定含硫氨基酸(Thera et al., 2017; Wright et al.，1998; 李玉玲等，2012)。过甲酸氧化法成熟可靠，然而也存在一系列的问题：①过甲酸氧化法回收率通常低于90%；②氧化过程中大部分酪氨酸会被破坏掉；③过甲酸氧化法步骤繁琐，需要时间较长；④过甲酸氧化法需要熟练的操作(过甲酸需和样品充分接触)，因此回收率不是很稳定(Manneberg et al., 1995)。叠氮化钠法简单易行，只需将足够浓度的叠氮化钠置于水解液即可。因此，本研究采用叠氮化钠氧化法测定半胱氨酸含量。氨基酸混标经过叠氮化钠氧化前后，色谱峰结果如图1所示。由图1可得，经叠氮化钠氧化后，胱氨酸原有峰位置上的峰消失，相应的出现磺基丙氨酸的峰位置。这表明在叠氮化钠存在条件下，胱氨酸和半胱氨酸可以被完全转化为磺基丙氨酸。

2.2 方法验证

2.2.1 方法可行性及重现性

氨基酸色谱峰之间的基线分离是定量的基础。如图1a所示，18种氨基酸基线分离效果较好，且磺基丙氨酸与胱氨酸前后无杂峰出现，表明该方法可以较好地定量半胱氨酸。

100 nmol的氨基酸标准连续进样6次，磺基丙氨酸和胱氨酸峰面积的RSD均小于5%，表明该仪器定量氨基酸的重现性良好(表1)。

表1 氨基酸分析方法学验证参数

2.2.2 样品精密度及回收率

样品加标回收率结果如表1所示。胱氨酸及半胱氨酸3个不同浓度(20，50，100 pmol)的加标回收率结果均在90%以上，回收率良好，表明使用的叠氮化钠氧化法满足方法学要求，可以用来测定样品半胱氨酸含量。

将草鱼肌肉组织进行6次平行的氧化水解处理，经氨基酸分析仪测定后，胱氨酸及半胱氨酸含量的RSD分别为5.40%和6.28%，说明氧化水解方法氧化产率稳定，测试结果精密度良好。

2.2.3 检测限及线性范围

由于生物组织样品中含硫氨基酸含量普遍较低(Lemes et al., 2009; Manceau et al., 2018)，本研究中磺基丙氨酸及胱氨酸线性范围浓度的验证只取10，50，100，200 nmol/mL 4个不同浓度的标准溶液进行验证，线性范围及检测限结果见表1。在10～200 nmol/mL浓度范围内，磺基丙氨酸和胱氨酸均有较好的线性范围，相关系数大于0.99。磺基丙氨酸及胱氨酸的最低检出值均较低，分别为15 pmol和12 pmol，表明仪器灵敏度较高。

2.2.4 优化叠氮化钠用量

为了找到合适的叠氮化钠用量，配置了一系列浓度梯度的叠氮化钠溶液，使用草鱼肌肉组织样品进行验证，测得磺基丙氨酸如表2所示。在叠氮化钠浓度低于0.15%时，磺基丙氨酸浓度逐渐提高；叠氮化钠浓度高于0.2%后，磺基丙氨酸浓度变化不大。因此本研究最终选择0.2%作为叠氮化钠最终浓度。

表2 叠氮化钠浓度对草鱼肌肉组织磺基丙氨酸检测结果的影响

2.3 方法应用

将采自鄱阳湖南湖不同种类的鱼类肌肉组织冷冻干燥、粉碎为均匀粉末后，进行氧化水解，含硫氨基酸测定结果见表3。结果表明，生物组织中含硫氨基酸含量一般较低。水草为代表的初级生产者半胱氨酸显著低于10 nmol/mg；以草鱼和白鲢为代表的初级消费者半胱氨酸含量与顶级消费者(乌鳢、鲶鱼等)差异不明显。这可能表明鄱阳湖重金属污染水平较低，不会导致明显的重金属毒性效应。

表3 鄱阳湖生物样品中半胱氨酸含量

3 结论

为了进一步理解巯基活性重金属生物富集机制，本研究首先建立了生物样品中半胱氨酸预处理方法及氨基酸分析仪测定方法。氧化水解方法的最佳条件为：在1.50 mg肌肉组织加入6 mol/mL HCl 0.89 mL， 2%的叠氮化钠溶液100 μL及1%苯酚溶液10 μL，氮吹5 min后于110 ℃下水解24 h。18种氨基酸分离度良好，可用氨基酸分析仪进行定量。磺基丙氨酸和胱氨酸均与相邻氨基酸实现良好的基线分离，在10～200 nmol/mL范围内两种氨基酸均具有较好的线性关系，分析方法检测限低(小于15 pmol)且具有较好的重复性(RSD<5%)，加标回收率高于90%。应用该方法测定了鄱阳湖水生生物半胱氨酸含量，半胱氨酸含量在不同消费者间差异不明显。综上所述，该方法可为深入研究巯基活性重金属生物富集问题提供理论基础。