肺炎支原体检测技术研究进展

贺凌煜，朱文勇，杨丽源，廖国阳

1.昆明医科大学，云南 昆明 650599；2.中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所，云南昆明650118

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染是社区获得性肺炎（community-acquired pneu⁃monia，CAP）最常见的病因之一，它与很多呼吸道感染性疾病有关，如支气管炎、肺炎，还可诱发哮喘等疾病[1]。肺炎支原体肺炎（MP pneumonia，MPP）通常被称为“行走性肺炎”，预后良好[2]。在肺炎支原体大流行期间，儿童和老人是易感人群，成人MPP 的发生率为社区获得性细菌性肺炎的4%～8%，在流行期分别增加了20%和70%[3-5]。尽管在感染预防和抗菌药物方面取得了重大进展，肺炎仍然导致显著的死亡率，世界卫生组织估计，下呼吸道感染是世界上最常见的死亡传染病原因，每年有近350 万人死亡。MP 感染的总体死亡率较低，但文献报道由MPP 导致进入ICU 病房的患者死亡率高达30%，尤其是老年人[6]。MP感染的患病率被广泛低估，因为大多数感染MP的患者很少有症状而寻求医疗，并且由于其假定的良性性质，缺乏具有良好敏感性和特异性的诊断测试，因此在很大程度上仍然未被诊断[7-9]。由于缺乏用于检测这种非典型呼吸道病原体的标准化、敏感和特异性的方法[10]，大多数采用经验诊断及治疗[11]。然而，目前肺炎支原体出现了大面积耐药现象[12]，因此，选择一种快速、灵敏、特异的检测方法特别重要[13]。

1 肺炎支原体检测方法

肺炎支原体目前的检测常用方法有物理学检测、培养法检测、抗原检测、血清学检测、分子生物学检测等。

1.1 物理学检测

支原体肺炎的症状和诊断是多方面的，会伴随着发热、心动过缓[14]。患者的听诊可以显示出晚期吸气性噼啪声或正常肺泡声，然而，由于毛细支气管炎，有时可以听到双侧和弦喘息[15]。放射学检查结果被归类为巩固组（脑叶或节段性巩固）和非巩固组（斑片状浸润，局部网状结节浸润或肺门旁支气管浸润）。Cho 等[15]认为在年龄较大的儿童中经常观察到巩固性病变，并且与更严重的临床特征相关。Tomoo 等[16]发现在成人病例中很少观察到胸腔积液，与免疫功能低下的患者相比，免疫功能正常的患者倾向于显示更广泛的阴影，由于血清学诊断方法无法提供100%可靠的诊断，因此物理和放射检查的整合对于准确诊断支原体肺炎至关重要。

1.2 培养法检测

培养法实验室是指将病人的咽试纸或痰样在培养基中进行培养，分别经过0.45 与0.22 μm的滤膜，最后如果得到澄清透亮的菌体则为肺炎支原体，但周期较长，一般最少需要1 周时间[17]。医院一般会取样涂皿，显微镜下观察是否会出现油煎蛋状的菌体，周期至少为1 周[18]。肺炎支原体感染的黄金诊断标准被认为是转换或升高的IgG 滴度，但抗体结果对儿童的年龄和免疫状态敏感，特别是难以获得恢复期血清[19]。有研究表明，口咽部若存在耐药菌或多重耐药菌以及对某些抗生素有天然耐药机制的细菌时，会造成肺炎支原体快速培养法检测结果出现假阳性[20]。

1.3 抗原检测

肺炎支原体抗原检测方法目前有ELISA 定量、免疫层析法、抗体-捕获酶-免疫测定法（Ag-EIA）、量子点标记抗体检测抗原。Miyashita 等[21]研究发现一种商业快速抗原试剂盒（日本东京旭化成制药公司）的诊断灵敏度仅为实时PCR 的60%。之后，Li 等[22]采用胶体金免疫层析法，以p1基因为靶点快速诊断肺炎支原体，并与实时PCR做比较，发现实时PCR 中的双标本阳性为阴性，胶体金分析的特异性和灵敏度分别为100%和97.4%，从而证明新开发的免疫层析抗原检测方法是鉴定肺炎支原体的一种快速、灵敏、特异的方法，具有潜在的临床应用价值，可用于肺炎支原体感染的早期诊断。Onari 等[23]使用PA 抗体和环介导等温扩增（LAMP）作为金标准评估，发现免疫层析法测试的灵敏度更高。Namkoong 等[24]使用照相显影增加免疫色谱测定灵敏度的新型银扩增免疫层析（SAI）系统，评估了快速肺炎支原体诊断系统，发现它能够以较低的抗原浓度检测所有测试样品，并且与其他病原体无交叉反应。与实时PCR 相比，该系统具有90.4%的灵敏度和100.0%的特异性；与LAMP 方法相比，该结果还证明了该系统的高性能，灵敏度为93.0%，特异性为100.0%。SAI 系统使用专用设备进行自动分析和读取，使其具有高度客观性，并且只需较少的人力，从而支持其在临床环境中的实用性。抗原捕获虽然不如PCR 敏感，但它的优势在于，不需要严格的实验室操作即可避免假阳性结果[25]。量子点标记抗体检测抗原的方法操作简单、快速，适用于早期的肺炎支原体诊断[26]。ELISA 抗原检测具有快速简单高效的特点[27]，但是本科室使用购买的产品交叉反应问题很突出。

1.4 血清学检测

血清学检测方法简单，速度较快，成本较低，是常规临床实践中肺炎支原体诊断的基本策略，已经通过灵敏分析检测不同抗体类别的广泛可用性得到了改善[28]。但血清学检测在感染早期的检测上存在很大的问题，如灵敏度特别低。目前有补体结合试验（CFT）、酶免疫试验（EIA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、间接免疫荧光抗体法（IFA）、电化学发光方法（CLIA）等。其中，PA 操作简单，但不能准确鉴别出IgM 抗体；IFA 易受实验人员的影响；相比之下CLIA 则比较稳定[29]。Chen 等[30]比较了 IFA 和 PPA 检测方法，发现当 MP抗体滴度为±1∶40 时应解释为阴性，PPA 显示出高特异性。Petitjean 等[31]证实，IgM EIA 血清学检测是儿童肺炎支原体感染早期诊断的有效工具，只要使用的EIA 检测是特异性的。在成人中，对EIA 测试的困难解释表明，准确诊断应该要求配对血清，结合对患者入院时收集的呼吸道标本的PCR 检测。检测肺炎支原体感染的黄金诊断标准被认为是血清转换或IgG 滴度升高，但抗体结果对儿童的年龄和免疫状态敏感，特别是在儿科医院难以获得恢复期血清[32]。由于IgM 早于IgG出现，因此血清中IgM 的检测是早期血清学诊断肺炎支原体感染的一种广泛使用的方法，特别是在儿童中[33]。血清学检测的灵敏度取决于是否在疾病发作后早期或晚期收集第一份血清样本以及配对血清的可用性，因为进行准确诊断需要配对的血清样本，在疾病发作后3～4 周出现滴度上升[34]。即使在恢复后，血清检测也会持续长时间阳性结果。因此，通常难以仅基于急性期[35]单个血清样品的抗体滴度进行诊断[36]。Beersma 等[37]用实时PCR 肺炎支原体DNA 检测作为金标准来评估12 种市售血清学测定（用于IgG 和IgM）和补体结合测试（CFT），很少有商业血清学检测用于检测肺炎支原体感染，在敏感性和特异性方面具有适当的性能，并且PCR 在确定的患者组中对于诊断肺炎支原体感染变得越来越重要。由于肺炎支原体是季节性流行病，并且晚期诊断增加了周围环境感染的风险，因此需要一种快速且实用的改进诊断系统[38]。

1.5 分子生物学检测

PCR 是目前直接病原体检测的首选方法，但一些PCR 相关方法提供了增强的灵敏度或更方便的处理程序，并已成功用于研究，这些技术包括实时PCR、巢式PCR、咽拭子样本的RT-PCR、多重PCR[39]。由于其比培养法更加节省时间且具有高灵敏度和特异性，因此广泛用于诊断[40]。Li等[41]用同时扩增和测试肺炎支原体（SAT-MP）的实时方法，通过靶向核糖体RNA 区域诊断肺炎支原体，并发现这种方法可以准确鉴定肺炎支原体，检测范围为101～107CFU/mL。这种优异的灵敏度可能归因于相同浓度的肺炎支原体的rRNA水平高于DNA。此外，SAT-MP 的扩增动力学比PCR 更有效（SAT-MP 一次反应可以产生 100 到1000 倍的扩增产物）。SAT-MP 在识别方面也具有理想的特异性。因为肺炎支原体的IgM 没有出现在感染初期阶段，应用SAT 等新的快速诊断工具来改善临床应用中的早期诊断和及时治疗至关重要。此外，SAT-MP 检测只需 2～3 h 即可完成。值得注意的是，SAT-MP 扩增产物也是RNA，这表明实验室污染和假阳性结果的风险降低[42]。Ratliff 等[40]通过实时 PCR 和 PCR 产物的双向测序使用LAMP 技术，例如在致病基因支原体DNA 测定中的LAMP 技术，证明其是临床环境下肺炎支原体实时PCR 的可接受且成本更低的替代品。Huang[43]等从敏感性（SEN）、特异性（SPE）、阴性似然比（-LR）、阳性似然比（+LR）、诊断比值比（DOR）和汇总接受者操作特征（SROC）等方面汇总分析了高水平文献，最后得出基于核酸序列的扩增是诊断肺炎支原体感染的可靠技术。

2 结语

肺炎支原体是临床上重要的病原体，定期流行[44]。近年来，在肺炎支原体呼吸道感染的诊断方面取得了重大进展，但对于肺炎支原体在呼吸道和其他感染中的作用仍有待深入研究。为了防止进一步传播到社区，需要一种快速简单的诊断工具。通过培养分离或配对血清样品检测肺炎支原体需要时间，并且在一般医疗机构中培养物分离是不可行的。分子生物学方法，例如PCR测试和LAMP 方法需要昂贵的设备，并且对通常性诊断肺炎支原体感染是不实用的。许多医院的PCR 检测经常缺乏适当的验证和标准化，质量控制研究揭示了常见的缺陷，导致假阴性和假阳性结果[45]。虽然正确和快速检测肺炎支原体感染对于开始适当的治疗至关重要，但是所有新开发的测试必须在应用之前进行广泛验证。因为，确诊肺炎支原体感染在临床上是具有挑战性的，仅仅根据临床体征和症状不可能诊断出这种疾病。因此，最佳诊断工具对于更准确地诊断和适当治疗肺炎支原体感染患者并减少滥用抗生素非常重要，需要继续进行深入研究。