生物钟基因在骨骼肌中对生肌形成和能量代谢的调控作用

孟凡飞，史套兴，宋伦

军事科学院军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所，北京 100850

内在的生理活动与外在的行为活动在时间上与日出日落24 h 的周期相一致的节律活动叫做昼夜节律，这种昼夜节律影响着几乎所有单细胞生物、植物和动物。昼夜节律产生的遗传学基础是生物钟。哺乳动物的中枢生物钟位于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），是生物钟系统的主起搏点[1]，在昼夜节律的产生、维持和调控中起主导作用。过去几十年中，各种研究已表明生物钟同样也存在于心、肺、肾、肝、骨骼肌等外周组织器官，称之为外周生物钟[2]。外周生物钟可以受到中枢生物钟通过神经、体液等方式直接或间接的调控，同时也能摆脱中枢生物钟的调控独立运行，起到生物钟系统次起搏点的作用。在自然状态下，生物钟受到光照、温度、食物以及化学物质刺激等环境因素的作用影响，生物钟时相以及相关基因的表达强度发生改变，来与外界环境保持同步。

生物钟调控网络中的核心基因包括clock（cir⁃cadian locomotor output cycles kaput）、bmal1（brain and muscle ARNT-like protein 1）、cry2（cryptochrome 2）、per2（period 2）、rev-erbα（nucle⁃ar receptor subfamily 1 group D member 1，NR1D1）和rorα（RAR-related orphan receptor α）等[3]。其中在生物钟调控网络中起主导作用的是2 个PAS-bHLH 转录因子家族的成员CLOCK 和BMAL1。CLOCK 与BMAL1 形成异二聚体，作用于cry、per、rev-erbα、rorα等靶基因的 E 反应元件（E box，CACGTG）并启动靶基因的转录过程[4]。cry基因的表达产物 CRY（Cryptochrome 1 和 2）和per基因的表达产物 PER（Period 1、2 和 3）可形成复合物，随着蛋白产物的不断积聚，积累到一定程度时可作为负性元件抑制CLOCK-BMAL1 异二聚体的转录活性，进而抑制cry和per基因的转录[5]。同时CLOCK-BMAL1 异二聚体也可以诱导视黄酸相关的孤束核受体 REV-ERBα（NR1D1）和 RORα（NR1F1）的表达，REV-ERBα可以与bmal1启动子区结合阻遏BMAL1 的表达，RORα可以作为正向调节因子促进BMAL1 的表达[6]。

1 骨骼肌中相关生物钟基因的表达

骨骼肌兼负运动、代谢、内分泌等多重生理功能，其功能机制涉及中枢生物钟的直接调控与其内部自身内源性生物钟的自我调控。骨骼肌昼夜节律现象的存在是从大鼠骨骼肌蛋白质合成存在24 h 的周期性变化中首次发现的，之后骨骼肌中昼夜节律的振荡器被Zylka 等提出[7]。2007年第一个骨骼肌生理节律转录组被Takahashi 提出，在小鼠中有215 个、大鼠中有107 个基因的表达存在昼夜节律性[8]。这些基因不仅包括在骨骼肌中起主要调控作用的生物钟基因bmal1、cry2、per2、rev-erbα和rorα以及相关的钟控基因dbp（al⁃bumin D-site-binding protein）和tef1（thyrotroph embryonic factor 1），同时也包括与骨骼肌功能相关的基因myod1（myogenic determination gene 1）等以及与骨骼肌能量代谢相关的基因pgc-1β（proliferator-activated receptor-γ coactivator 1β）、pdk4（pyruvate dehydrogenase kinase-4）等。

生物钟基因对骨骼肌生理功能的调控作用包括肌肉生长和维持、收缩功能、结构组织、葡萄糖代谢和能量生成[9]。利用整体或骨骼肌局部生物钟基因缺陷技术构建的小鼠模型为我们提供了遗传学工具来研究生物钟基因环路在骨骼肌中的功能机制。clock基因缺陷小鼠由于线粒体含量减少、线粒体活力下降以及非正常线粒体数量增加，表现出了骨骼肌肌力和运动耐力的下降，同时由于肌动蛋白、肌球蛋白和肌联蛋白表达的减少造成了骨骼肌结构的变化[10]。有研究表明，BMAL1 是骨骼肌增殖、分化、生肌祖细胞再生的正向调控因子。在bmal1基因缺陷小鼠模型中，除了一些昼夜节律行为和一些节律代谢活动的改变，还会出现骨骼肌纤维直径的减小、肌纤维类型的转变、肌节结构的改变、骨骼肌对胰岛素敏感性的降低；bmal1基因缺陷小鼠从8 周龄开始就已经表现出骨骼肌重量的降低，同时肌卫星细胞的增殖能力达到峰值，在40 周龄时基因缺陷小鼠不仅表现出寿命的降低，同时骨骼肌重量也出现降低，低至正常小鼠骨骼肌重量的一半[11]。rev-erbα基因缺陷的小鼠会影响骨骼肌细胞的分化，出现糖脂代谢平衡的紊乱，同时由于线粒体活性的下降和骨骼肌内自噬反应的增强导致小鼠骨骼肌运动能力减弱[12-14]。

2 生物钟基因对骨骼肌生肌形成的调控

骨骼肌是胚胎发育过程中最早形成的组织之一，是由体节细胞经过增殖、迁移、分化而形成。构成骨骼肌的基本单位是肌纤维，肌纤维的类型、直径、密度、肌节长度等都决定了骨骼肌的收缩力度、运动耐力等生理功能。生肌决定因子（myogenic determination gene，MyoD）在骨骼肌的生长发育过程中起到了决定作用[15]。生肌决定因子家族不仅与哺乳动物胚胎期肌细胞的增殖、分化、融合、肌纤维数量和体积的增大有关，还可以激活肌卫星细胞，将成纤维细胞、平滑肌细胞等转化为骨骼肌细胞。MyoD 家族主要包括4 个成员，分别是生肌决定因子（MyoD）、肌细胞生成素（myogenin，MyoG）、生肌因子5（myogenic factor 5，Myf5）和生肌因子 6（Myf6）[16]。

生物钟基因对骨骼肌结构和功能的调控机制之一是BMAL1/CLOCK 异二聚体作用于myod1启动子区E 盒（E-box），从而介导了myod1的节律性振荡表达。转录组学分析表明，尽管MyoD1 在野生型小鼠骨骼肌中呈现振荡表达，但这种振荡表达在clock以及bmal1基因缺陷小鼠中均消失。然而，在clock和bmal1基因缺陷小鼠中虽然MyoD1 的振荡表达受到影响，但表型上骨骼肌的生肌形成过程是正常的，这就说明存在某种相应的补偿机制，这种补偿机制很可能是其他的生肌调节因子例如Myf5 发挥了补偿作用[17-18]。在马和斑马鱼的骨骼肌中，Myf6（Mrf4）的表达是随着BMAL1 和CLOCK 表达时相的变化而变化的，这说明其他的生肌调节因子也可能直接受到生物钟基因的调控,对骨骼肌生肌过程产生影响。

BMAL1/CLOCK 异二聚体除了直接调控MyoD1 的表达，也有报道发现BMAL1 通过转录水平调控Wnt 信号通路中的关键因子来调控成肌细胞的分化。事实上bmal1基因缺陷小鼠在受到例如冻伤等创伤后，出现骨骼肌再生缺陷和骨骼肌修复的减弱，肌卫星细胞开始增殖分化，但肌卫星细胞的增殖能力明显减弱，这其中部分是由于BMAL1 表达的抑制造成Wnt 信号通路中关键因子表达的抑制。在bmal1基因缺陷小鼠的成肌细胞中，通过激活Wnt 信号通路的表达活性可以部分恢复成肌细胞的分化。这说明在胚胎形成过程中，Wnt 信号通路对骨骼肌细胞分化起到了一定作用。

在成肌细胞分化过程中BMAL1 表达不断增加，在成肌细胞退出细胞周期并分化时BMAL1 的阻遏物REV-ERBα的表达就会受到抑制[19]。在小鼠C2C12 肌源性细胞系中，过表达REV-ERBα可以抑制成肌细胞的分化，MyoD1、MyoG 及肌节细胞中的α肌动蛋白的表达受到抑制。与此同时，RORα 结合与 REV-ERBα 相同的基因启 动子序列，激活靶基因的表达[20]。因此，REV-ERBα 与RORα都在肌源性分化过程中发挥重要作用。

一旦细胞进入生肌形成过程，都会发生分化、融合并表达肌球蛋白等特异性功能蛋白。生物钟基因对成肌细胞的融合以及对骨骼肌功能的影响报道较少。McCarthy 等已经证明了编码骨骼肌收缩基因的表达蛋白是具有昼夜节律的，其中某些基因编码因子如肌球蛋白重链、肌钙蛋白在clock基因缺陷小鼠中是明显下调的[21]。钟基因在骨骼肌纤维形成与转化以及收缩功能的建立等方面的贡献仍须深入研究。

3 生物钟基因对骨骼肌能量代谢的调控

生物钟基因可以调控机体内的能量代谢过程，生物节律的紊乱往往对这一调控过程产生影响，造成机体内能量代谢自稳态的失衡，进而导致肥胖、胰岛素抵抗等相应症状的出现。在哺乳动物中，骨骼肌是糖脂代谢的主要器官，生物钟对骨骼肌能量代谢的调控是机体能量代谢反应的重要组成部分。生物钟基因缺陷动物模型会出现骨骼肌能量代谢的紊乱。骨骼肌氧化分解碳水化合物和脂肪酸的过程也存在昼夜节律性，同时在培养的骨骼肌细胞中发现葡萄糖的摄取也存在昼夜节律[22]。bmal1和clock基因缺陷小鼠的葡萄糖和脂质昼夜节律性变化消失。clock基因缺陷小鼠长期饲养后会出现肥胖、高血糖的表现[23]。此外，bmal1、per1/2双缺陷小鼠和cry1/2双缺陷小鼠会出现葡萄糖不耐症[24-25]。

组蛋白去乙酰基转移酶Sirtuin-1（Sirt1）在培养的肌管细胞中可调节葡萄糖氧化和脂肪酸氧化反应[26]。CLOCK∶BMAL1 异二聚体上调NAMPT的表达，NAMPT 可介导NAD+的合成并表现出节律性。由于NAD+是Sirt1 的重要辅助因子，因此NAD+介导了Sirt1 活性的昼夜节律变化[27]。Sirt1通过使BMAL1 去乙酰化，降低了CLOCK∶BMAL1异二聚体的转录活性，从而使其靶基因表达受抑。另外，Sirt1 可使PER2 去乙酰化并促进其降解[28]。因此，Sirt1 是将钟基因与骨骼肌能量代谢联系起来的一个关键因子。LKB1（肝激酶B1）在AMP/ATP 比增加时激活AMPK 能量代谢通路。AMPK 通过诱导Sirt1 的去乙酰基转移酶活性介导PGC-1α（过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活剂1α）的去乙酰化，而PGC-1α是调节骨骼肌中线粒体的合成与氧化呼吸的关键信号分子[29]。不同环境刺激（例如运动或禁食/进食）都可以通过调节骨骼肌中AMP/ATP 和NAD+/NADH 的比例分别控制AMPK 和Sirt1 的活性，进而通过靶向PGC-1α调节骨骼肌中的线粒体活性并对骨骼肌能量代谢产生影响[30]。

昼夜节律抑制性基因rev-erbα在骨骼肌的能量代谢过程中同样发挥重要作用。在骨骼肌中发现rev-erbα在氧化纤维中高表达并通过抑制线粒体自噬来促进骨骼肌的氧化能力[31]。作为配体依赖性核受体，REV-ERBα可受合成的配体调节，REV-ERBα的合成激动剂在小鼠中表现出抗肥胖和降脂功效。通过合成激动剂激活REV-ERBα可以诱导脂肪酸氧化，抑制骨骼肌中的脂质合成基因，REV-ERBα可能在体内起到降脂的重要作用[32]。研究表明REV-ERBα可以促进葡萄糖的优先使用，减少脂质的利用，rev-erbα基因缺陷小鼠表现出轻度高血糖症和脂肪酸利用增加[12]。

4 结语

目前生物钟基因对骨骼肌中生肌形成和能量代谢的调控已经得到众多研究者的认同，但研究方向大都集中在BMAL1∶CLOCK 异二聚体的调控作用，对于骨骼肌中表达的其他生物钟基因cry2、per2、rev-erbα和rorα以及相关钟控基因dbp和tef1的研究相对较少。基于生物钟基因对生肌形成和能量代谢的研究，我们可以设想这些钟基因及钟控基因可以独立抑或与BMAL1∶CLOCK 异二聚体共同发挥重要的调控作用，构成生物钟基因对骨骼肌的调控网络。同时，机体的能量代谢也是在骨骼肌、肝脏、脂肪等产能器官相互协同作用下进行，我们是否可以找寻作为产能器官的外周生物钟与SCN 中枢生物钟之间的关系，建立起在生物钟主导下的全身能量代谢网络，从而更全面地分析生物钟对机体能量代谢的调控。另一方面，人体长期处于睡眠剥夺状态或睡眠时间不规律都会造成人体节律紊乱，引起生物钟基因在骨骼肌中表达的改变，从而对骨骼肌生理运动功能以及能量代谢造成影响，进而降低人体作业能力。生物钟基因调控的生肌调节因子和糖脂代谢的关键酶可以作为未来改善睡眠节律紊乱造成的作业能力下降的潜在作用靶点，相关干预药物的研发具有十分重要的现实意义。