动物源性食品中氯霉素残留检测方法进展

缪宇腾，郁宏燕，陆利霞，熊晓辉

(1.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800；2.昆山市市场监督管理局 食品质量监管队，江苏 苏州 215300)

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种使用时间较长、应用广泛的抗生素。长期食用氯霉素残留的食物，会使机体菌群产生耐药性，导致机体正常菌群失调[1]。

美国、欧盟规定氯霉素残留限量标准为不得检出[2]。目前，我国对氯霉素的检测定量方法主要包括高效液相色谱、气相色谱等[3]。高裕锋等[4]对广东省7个城市水产品中氯霉素残留情况进行了调研，最终水产品中氯霉素检出率高达10%，且7个城市均存在氯霉素检出的情况，情况不容乐观。

目前，国家标准中用于氯霉素检测的方法包括高效液相色谱、气相色谱-质谱以及液相色谱串联质谱等[5]，但耗时长，检测设备昂贵。方便快捷的氯霉素检测方法逐渐受到关注，包括电化学生物传感器、表面等离子体共振、压电免疫传感器、荧光免疫分析法和化学发光等。本文中，笔者分析了各种氯霉素检测方法，对各方法的原理和优缺点进行了介绍，并对氯霉素检测未来发展方向进行了探讨和展望。

1 氯霉素残留量检测方法

1.1 电化学传感器(ECBSS)

ECBSS是由生物材料作为敏感元件，电极作为转换元件，以电势或电流作为特征检测信号的传感器。利用电化学传感器进行物质检测时，待测物扩散进入生物活性材料，通过分子识别，产生生物学反应，经过电极等转化为光电等信号，放大信号，最终得到待测物浓度。

近年来基于分子印迹(MIPs)的电化学传感器成为研究热门，传感器以分子印迹技术作为模板的识别元件，将MIPs电活性材料修饰电极后，可以制备出用于特定识别目标分子的高灵敏传感器[6]。

Munawar等[7]采用新型纳米杂化材料构建三维印迹纳米结构。通过两步主要过程将铜纳米粒子沉积在碳纳米管上，然后在3D CNTs@Cu NPs上包覆分子印迹聚合物而形成杂化结构，最终一层层地组装成一个电化学传感器用于氯霉素的检测。结果表明在最佳实验条件下，检出限(LOD)为10 μmol/L。由于特定的结合位点产生选择性的传感器信号，对氯霉素有100%的选择性，表明该方法可以用于对氯霉素的灵敏检测。Chen等[8]使用二硫化钼聚苯胺(MoS2/PANI)复合纳米材料设计了一款用于氯霉素检测的电化学传感器，该传感器检测范围为(1.0×10-7)～(1.0×10-4)mol/L，LOD为6.9×10-8mol/L，由于MoS2和聚苯胺(polyainlin，PANI)的协同作用，该传感器具有特殊的三维结构，更容易吸附氯霉素分子，故灵敏度更好。Meenakshi等[9]展示了一种无介体电化学敏感传感器用于检测氯霉素。通过表面活性剂辅助剥离法合成了石墨烯纳米片(GNFs)修饰在玻碳电极(GCE)上。氯霉素使用无介体玻碳电极平台进行敏感检测，在最佳实验条件下，LOD为0.38 nmol/L。Zhao等[10]制造了一种电化学仿生传感器用于检测牛奶和蜂蜜中的氯霉素残留量，使用铂薄膜微电极(Pt TFME)可以对样品量较少的基质进行检测，在最佳实验条件下，LOD为0.396 1 nmol/L。加标牛奶样品检测过程中，使用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)验证结果一致，表明该方法具有良好的准确性。Cardoso等[11]采用分子印迹和电化学传感器的方法，设计了一款可以应用于现场检测的仪器，检测范围从1 nmol/L～100 μmol/L，方法简单，操作性强，适用于现场的快速检测。

相比较而言，经过电极材料的优化，传感器的灵敏度被逐步提高，三维纳米材料的应用使分子吸附更加容易，克服了电化学传感器灵敏度不高、检测范围较窄的缺陷。不同的分子印迹材料对传感器的灵敏度存在不同影响。

1.2 荧光探针技术(fluorescent probe technique)

荧光探针是以荧光物质作为指示剂，并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光，通过对所产生荧光的检测，实现对被检测物质的定性或定量分析。荧光分子探针通常由识别基团、荧光基团和连接体三部分组成。由于投资小、附加值高等优势，广泛应用于日常食品检测中。

Wang等[12-13]基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)和单链DNA结合蛋白，利用适配体及量子点与胶体金距离小于10 nm会发生能量共振转移现象这一特点，将单链DNA结合蛋白结合到硒化镉(CdSe)量子点上面得到QDs@SSB受体。金纳米粒子上面通过Au-S键结合巯基化的适配体得到受体Au@apt。在最佳实验条件下，荧光强度随着氯霉素质量浓度从0.005 ng/mL到100 ng/mL线性增加。LOD为3 pg/mL。检测时间小于30 min，通过改变适配体，也可以应用于其他物质的检测中。Miao等[14]采用相同原理，在Wang等[12-13]基础上优化了受体，利用纳米金粒子与SiO2复合物结合形成SiO2@Au受体，可以极大地催化CdSe量子点荧光强度值的猝灭，导致荧光强度变化剧烈，并用于CAP量化。实验结果表明，CAP检测线性范围为0.001～10 ng/mL，LOD为0.000 2 ng/mL。该方法检出限更低，适用于微量残留的检测。Li等[15]利用静电纺丝技术制备碲化镉(CdTe)量子点/聚乳酸(PLA)纳米荧光纤维探针，通过静电纺丝的方法将量子点结合在纤维膜上，用于提高量子点稳定性。在最佳实验条件下，体系的荧光猝灭强度与氯霉素质量浓度在10～80 μg/mL范围内呈良好线性关系，其LOD为0.814 μg/mL。结果显示，荧光探针的方法检测氯霉素比电化学传感器更加灵敏，线性范围达到了4个数量级，且检出限比电化学方法更低。

Tan等[16]利用牛血清白蛋白稳定的金纳米团簇(BSA-AuNCs)荧光法来测定氯霉素，在最佳条件下，可以对微量的氯霉素进行检测，其线性范围为0.10～70.00 μmol/L，LOD为33 nmol/L(信噪比=3)，应用于牛奶样品的检测时，回收率为98.4%～106%。刘长青等[17]采取类似的方法，利用BSA-Au NCs荧光体系，改良形成一种可以应用于氯霉素检测的新型检测方法，此方法LOD为1.2×10-9mol/L，应用在实际牛奶样品的检测时，回收率为98.8%～101.75%。

1.3 表面增强拉曼光谱技术(surface enhanced raman spectroscopy，SERS)

拉曼光谱技术是一种能提供拉曼光谱特征和光谱信息的光谱技术，然而，拉曼散射的产率很低，在大多数情况下都会产生微弱的拉曼信号[18]。表面增强拉曼光谱技术(SERS)是拉曼光谱中的一种，利用一些分子被吸附到某些粗糙的金属(如金、银、铜等)表面时，拉曼散射强度会增加104～106倍，SERS信号的强弱与拉曼的增强基底有着密切的关系[19]。

Ji等[20]利用胶体金纳米粒子作为基底，可以显著提高CAP的拉曼光谱信号。以1 344 cm-1处的拉曼峰作为食品样品中CAP的定量分析指标。最佳实验条件下，LOD为0.1 μg/mL。通过对实际鸡肉样品的测定，其变异系数为1.5%左右。Yu等[21]研究并开发了分散磁性固相微观表面增强拉曼散射光谱技术(Dis-MSPME-SERS)。采用层层组装的方法制备了一种多功能磁性石墨烯基底(Fe3O4@GO@Ag)，利用这种三元基底对氯霉素的残留进行测定。在最佳实验条件下，定量限(LQD)和LOD分别为1.0×10-8和1.0×10-10mol/L，通常情况下检测时间<10 min。利用这种三元基底提高了灵敏度，改善了SERS难以对多种分子混合体系检测的弊端。刘治刚[22]采用同样的方法、基底，将其应用在农残和地沟油的检测中，同样取得良好的效果。Ding等[23]用均匀和单分散的胶体金(Au NPs)当作该方法的底物，在最佳实验条件下，其检出限为1×10-8mol/L，并用HPLC对该方法进行了验证，两者结果一致，表明其准确性良好。

Xie等[24]通过一种新型杂化分子印迹材料(MIP-Au)作为基底，制作了一种可以应用于快速检测氯霉素的SERS传感器。该传感器可以用于实际牛奶样品的检测中，其检出限为0.1 μg/mL，灵敏度不如刘长青等[17]的荧光方法，但检测时间更短，通常在10 min内得到结果。Yang等[25]用磁分离和表面增强拉曼光谱的方法，设计出一款新型传感器用于氯霉素的检测，使用抗体缀合磁珠代替固体基质作为支持材料和分离工具，借助磁体，达到良好的富集、浓缩作用。该传感器检测线性范围广(1～1×104pg/mL),检出限为1.0 pg/mL。Gao等[26]将分子印迹和表面增强拉曼光谱相结合(MIPs-SERS)，开发了一种生物纳米传感器，传感器可以实现对牛奶、蜂蜜等实际样品的氯霉素加标检测，效果良好。这种传感器价格便宜、方便快捷，最快可以在15 min内得出结果。

SERS活性基底主要有贵金属电极活性基底、金属溶胶活性基底、双金属纳米活性基底等几类，通过开发不同的基底，灵敏度也越来越高。相比较其他方法，该方法更适合现场的快速检测，相对比较完善，具有一定潜力。

1.4 色谱分析(chromatography and chromato-graphic analysis)

高效液相色谱(HPLC)是一种以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲溶液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，柱内样品分离后，进入检测器检测[27]。根据检测器的不同逐渐发展出液相色谱串联质谱法(LC-MS)和超高效液相色谱(UPLC)等。

Chu等[28]利用电纺纳米纤维的固相萃取技术(PFSRE)和HPLC测定牛奶中的氯霉素，在最佳实验条件下，LOD为0.2 mg/L，线性范围为0.5～10 mg/L，回收率在97.5%～104.0%范围内。加标样品的日内和日间RSD分别为4.6%～7.1%和8.4%，均低于10%。证明该方法精密度良好。王安伟等[29]采用HPLC测定罗非鱼中的氯霉素残留量，在最佳实验条件下检测限为 0.02 μg/g，回收率为80.5%～107.1%。

Amelin等[30]使用高效液相色谱-高分辨质谱法检测对肉类、牛奶等7种样品进行检测，不仅显示出氯霉素的存在，而且显示出其琥珀酸的形式。在最佳实验条件下，LOD和LQD分别为0.1 μg/kg和0.3 μg/kg。分析结果RSD<10%。分析检测时间小于1 h。niegocki等[31]提出了一种可以测定20多种生物基质中氯霉素的方法，提取物通过SPE柱分离后，通过LC-MS/MS以电喷雾模式分析氯霉素。该方法检出范围为0.10～10 μg/kg。回收率在92.1%～107.1%，重复性小于11.0%。

Ashraf等[32]建立了一种测定蜂蜜中氯霉素残留量的超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS/MS)，并结合电子喷雾电离技术，利用多重反应监测跃迁串联质谱法对目标物进行了鉴定，结果表明该方法定量限、决策限和决策能力分别为0.15、0.10和0.20 μg/kg。Kivrak等[33]采用和前者类似的技术，引入超声波提取的方法，可以对蜂蜜中23种抗生素同时检测。结果表明，氯霉素LOD、LQD分别为0.61和0.27 μg/kg。色谱分析方法灵敏度高，可重复性强，结果可靠。但是对操作人员有一定的技术要求，且方法较SERS繁琐，检测成本高。

1.5 免疫学技术(immunological technique)

1.5.1 酶联免疫吸附法(ELISA)

酶联免疫法，该方法核心就是让抗体与酶复合物相结合，然后通过显色来检测。ELISA可用于测定抗体，也可用于测定抗原。ELISA试剂盒具有高效、灵敏、稳定且重现性好等特点，广泛应用于医疗和食品等日常检测中。

Tao等[34]建立了一种非常敏感的直接竞争酶联免疫吸附试验(CL-ELISA)，该方法用于检测实际样品效果良好。在最佳实验条件下，LOD为0.7 ng/L，线性范围为2.1～92.4 ng/L，该方法所需时间较短，15 min内可以得到结果，适用于快速检测实际样品的氯霉素残留。通过与安徽省地方标准DB34/T 821—2008酶联免疫法的对比，优化后的ELSA方法检出限远低于标准0.1 μg/kg的要求。Chughtai等[35]开发和验证了一种直接竞争的ELISA方法。结果表明，加标后的牛奶样品平均回收率为73%～100%，方差系数为7%～11%，决定限度(CCα)和检测能力(CCβ)分别为0.10和0.12 ng/mL。

Jester等[36]用LC-MS/MS的方法评估了一种市场上销售的ELISA试剂盒，验证发现在加标的蟹和虾肌肉样品中ELISA具有良好的重复性，CAP的回收率范围为102%～107%，表明ELISA试剂盒快检可以应用于对大量样品的筛选，为以后的定量检测做准备。

1.5.2 化学发光免疫分析(chemiluminescence immuno assay，CLIA)

化学发光免疫分析，是将具有高度灵敏的化学发光测定技术与特异性的免疫反应相结合。当有机分子吸收化学能后发生能级跃迁，产生一种高能级的电子激发态不稳定的中间体，当其返回到基态而发出光子，这就是化学发光，化学发光免疫技术通常包括2个部分，即免疫反应系统和发光化学系统。该方法适用于各种抗原、抗体和药物等分析检测。

Liang等[37]开发了纳米金磁性微球(Au-MNPs)的直接竞争化学发光免疫测定法(CLIA)，

通过使两种CAP抗原(CAP碱基和CAP琥珀酸酯)固定在微球的表面上，获得两种不同的抑制曲线。两种方法的50%抑制浓度(IC50)值分别约为0.044和0.072 ng/mL，LOD分别约为0.001和0.006 ng/mL。两种方法检出限均远低于传统ELISA方法。Wang等[38]制备了Fe3O4@SiO2磁性纳米粒子(Fe-MNPs)应用于化学发光免疫检测。使用两种不同类型的功能化Fe-MNP(胺官能化Fe3O4@SiO2和羧酸官能化Fe3O4@SiO2)的两种方法检测样品。两种方法的IC50值分别约为0.024和0.046 ng/mL，LOD分别约为0.000 2和0.001 ng/mL。相比较使用纳米金磁性微球作为载体，该方法成本相对较低并且不影响灵敏度。

1.5.3 胶体金免疫层析技术(gold immuno chromatographic assay，GICA)

胶体金免疫层析技术是一种是以胶体金颗粒作为示踪标志物，以显示抗原一抗体反应的一种免疫标记技术，胶体金在弱碱环境下带负电荷，由于静电作用，与蛋白质分子的正电荷基团结合，形成牢固的金标结合物。近年来，胶体金免疫层析技术在食品安全领域的应用逐渐广泛，主要应用于水产品中氯霉素的检测。

Zhou等[39]制备了平均直径约为20 nm的纳米金颗粒，构建胶体金免疫试纸条，检测水产品中的氯霉素残留量，该方法CAP的检出限为0.5 ng/mL。用于实际样品的检测时，色谱分析时间小于10 min，在不同温度下，色谱分析带的储存寿命大于90 d。Zhou等[40]建立了氯霉素、链霉素、四环素和β-内酰胺类抗生素这4种抗生素的四联体金免疫荧光分析法，对氯霉素的可视化检测限为2.4 ng/mL;氯霉素的检测范围为0.019～1.2 ng/mL，线性相关系数大于0.97。通过对比地方标准(DB34/T 2254—2014)水产品中氯霉素残留的检测-胶体金法，可以发现两种方法的检出限均远远低于地方标准提供方法的检出限。

免疫分析法特异性强，灵敏度高，成本低，安全可靠，但其检测限不高，定量检测受到一定的限制，不如色谱方法，但可以为国标方法定量检测提供依据。检测阳性的样品需要通过现行有效的LC-MS/MS，或气相色谱串联质谱(GC-MS/MS)验证。

1.6 表面等离子共振技术(surface plasmon resonance，SPR)

表面等离子共振技术，根据入射光与金属表面的等离子发生共振的原理，依靠光在其表面能量的变化来检测分子之间的相互作用。该方法无需标记样品，故样品所需用量少，可以动态检测生物分子相互作用的全过程，具有高灵敏度、检测过程简单等优点。然而由于仪器价格昂贵、分析时所用芯片较多，故成本高、难以大面积推广。目前该技术多与其他检测技术连用，用于提高检测灵敏度。

Xia等[41]以表面等离子共振技术为基础制作了一种生物传感器，用于检测复杂样品中氯霉素和庆大霉素的含量。将抗原和牛血清白蛋白(BSA)两种结合物共同固定在传感器芯片上，通过梯度洗脱后顺序检测，最终得出2种抗生素的含量，对于氯霉素的检测，LOD为5.28 ng/mL。该方法提高了样品同时检测的能力，但氯霉素抗体的解离能力有限，该传感器还有很大的提升空间。Kara等[42]基于MIP和SPR技术结合检测CAP，通过MIP纳米粒子制备了具有CAP识别位点的SPR纳米传感器，该传感器对蜂蜜样品检出限为40 ng/kg。选择弗洛芬尼(Flovanni，FLP)和甲砜霉素(thiamphenicol，TAP)作为竞争者以确定纳米颗粒的选择性，通过实验确定CAP/TAP的选择性常数为8.86，CAP/FLP的选择性常数为8.36，表明该方法具有良好的选择性。

2 不同检测方法的比较

色谱技术是国际上公认的氯霉素残留检测方法，应用于欧盟、日本和韩国等标准中，具有高灵敏度、结果准确、重复性好等优势。然而该方法不适合大量样品的检测，现阶段单一的色谱技术已经不能满足国际上对氯霉素检出限的要求，如我国2015年后使用液相色谱串联质谱的方法全面替代传统的高效液相色谱法。

免疫分析法特异性强、灵敏度高、成本低廉并且安全可靠。然而该方法检出限不高，定量检测受到一定限制。表面等离子共振技术具有高灵敏度、检测过程简单等优点。然而由于仪器价格昂贵、分析时所用芯片较多，故成本高、难以大面积推广。表面增强拉曼光谱技术检测范围极其广，且不受样品状态的影响。可以检测固体、流动的液体。然而该技术发展仍有待改进，优化样品光路、设计新型分光计等都可以进一步提高拉曼检测能力。

电化学传感器以其高灵敏性、高稳定性、高选择性以及简捷、快速、经济等优点，被广泛应用于氯霉素的检测，是一种流行的检测方法，目前关于电化学研究较为广泛。但是目前的研究还存在线性范围窄、离子干扰等问题，尤其是化学修饰电极的研究应用还处在探索试验阶段，因此电化学传感器测定氯霉素的研究还处在不断发展中。

3 结论与展望

随着人民生活水平的提高，食品安全问题日益成为人们关注的焦点。为了满足实际检测的需要，各种实验方法也在快速发展。针对目前的研究现状和实际发展，开发创新型的检测方法势在必行。笔者认为，纳米材料的应用提高了各种方法的灵敏度，如磁性纳米材料的应用、半导体量子点的应用、纳米金颗粒的应用等，为日益严格的食品检测提供了新的契机，其覆盖了食品检测的各个环节，包括样品的前处理、传感器的制备以及检测分析信号的产生等。

目前氯霉素检测方法取得了一定的进展，但由于食品基质复杂多样，实际样品基质干扰严重，并且氯霉素残留量为不得检出，单一的检测技术已经不能满足检测灵敏度的要求。前处理技术应当与新型仪器设备组合使用，实现萃取进样的智能化，使得分析更加快速简洁化，样品提取过程中应当减少有机溶剂的使用，合成高选择性的固相聚合物材料。目前可以通过固相萃取、微萃取和磁珠分离技术等样品前处理技术与食品安全快速检测技术联用，建立用于复杂食品样品分析的快速检测方法。在未来的研究中，应当开发小型化、便携、稳定性好以及灵敏度高、可定量的传感器。

此外，各级政府及食品全链条应当加强对氯霉素非法使用的监督管理工作，从源头上对氯霉素的使用精细管控，从而从源头上杜绝氯霉素的非法添加。